瘀肿消温度敏感型原位凝胶的提取方法优选

徐晓霞 欧阳荣* 廖建萍

（1 湖南中医药大学，湖南 长沙 410007；2 湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007）

瘀肿消温度敏感型原位凝胶是由生栀仁、大黄、金银花、当归等十一味中药组成，具有活血止痛、清热消肿、散瘀通络的作用，临床上应用于治疗急性软组织损伤，具有消肿止痛快、疗程短、疗效好的优点，但原剂型（散剂）存在使用不便，易弄脏衣物等不足，阻碍其进一步推广运用[1]。于是我们根据透皮吸收理论（TTS）[2]，将其改为温度敏感型原位凝胶[3-5]，本文对其提取方法及工艺研究进行报道。

1 仪器与试药

Agilent110高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；分析天平DT-100（北京光学仪器厂）；不锈钢电热恒温水浴锅（北京市医疗设备厂）；KQ-600型超声波清洗器（昆山市淀山湖检测仪器厂）。

甲醇为色谱纯；其余试剂均为分析纯，水为注射用水。

大黄素、绿原酸、生栀仁等药材购自湖南三湘中药饮片有限公司，经湖南中医药大学第一附属医院药检室鉴定确认。

2 方法与结果

2.1 指标成分的测定

2.1.1 色谱条件

色谱柱为Kromasil Cl8柱（250 mm×4.6 mm，5μm）。大黄素流动相：甲醇-0.1%磷酸（82∶18）；检测波长：254nm；柱温：45℃；流速：1mL/min。绿原酸流动相：甲醇-0.1%磷酸（28∶72）；检测波长：327nm；柱温：25℃；流速：1mL/min。栀子苷流动相：甲醇-0.1%磷酸（28：72）；检测波长：238nm；柱温：25℃；流速：1mL/min。

2.1.2 对照品溶液的制备

精密称取大黄素对照品5mg于50mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，精密量取甲醇液5mL到25mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度即得大黄素对照品溶液。精密称定绿原酸、栀子苷各对照品3.5mg、5mg置25mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得绿原酸、栀子苷对照品溶液。

2.1.3 标准曲线的制备

精密吸取各浓度的对照品溶液2、4、6、8、10、20µL注入高效液相色谱仪，以峰面积值Y为纵坐标，对照品进样量X（μg）为横坐标进行线性回归，回归方程为：大黄素Y=4570.1X+4.8197，r=0.9993；绿原酸Y=1278.8X-9.1475，r=0.9998；栀子苷Y=1583.5X-44.638，r=0.9998。结果表明大黄素、绿原酸、栀子苷的进样量分别在0.04～0.40μg、0.28～2.80μg、0.40～4.0μg的范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.1.4 供试品溶液的制备

按2.3项下的提取方法得提取液，用0.45µm微孔滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液，即得供试品溶液。在上述色谱条件下进样10µL，测定大黄素、绿原酸、栀子苷峰面积。

2.2 浸膏得率的测定

分别精密吸取按2.3项下的提取方法得提取液20mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，在105 ℃干燥3h，取出，置干燥器中冷却30min后迅速称重，计算浸膏得率。浸膏得率=（浸膏重量/药材重量）×100%。

2.3 提取方法的比较

表1 提取方法比较结果表

表2 因素水平表

表3 L9(34)正交试验结果表

表4 方差分析表

2.3.1 水煎法

取本品12.6g，置圆底烧瓶中，浸泡1.0h，第1次加12倍水、回流提取2.0h，第2次加10倍水、回流提取1.5h。滤过，合并滤液，并定容至200mL。

2.3.2 乙醇回流法

取本品12.6g，置圆底烧瓶中，浸泡1.0h，第1次加10倍70%乙醇、回流提取2.0h，第2次加8倍70%乙醇、回流提取1.5h。滤过，合并滤液，并定容至200mL。

2.3.3 CO2超流界后药渣用乙醇回流法

取本品250g按CO2超流界最佳萃取条件（萃取压力30MPa、萃取温度50℃、萃取时间2h）萃取后，药渣按2.3.2项下乙醇回流法进行提取。

上述3种方法所得提取液，按2.1.4项下的方法测定含量，结果见表1。

综合评分=各样品中大黄素含量/该组中大黄素最大含量×0.3×100+各样品中绿原酸含量/该组中绿原酸最大含量×0.30×100+各样品中栀子苷含量/该组中栀子苷最大含量×0.2×100+各样品醇浸出物/该组中最大醇浸出物×0.2×100。

表1说明水煎法大黄素、绿原酸、栀子苷损失量最大，提取量最少；乙醇回流法大黄素、绿原酸、栀子苷损失量最少，提取量最大。

2.4 醇取工艺条件的优选

由于乙醇回流法提取有效成分所得综合评分最高，因而选择乙醇回流法对提取工艺条件进行优选。影响乙醇回流法的因素有乙醇浓度、乙醇倍数、回流时间、提取次数等4个因素，提取次数根据单因素试验结果确定提取次数为2次，其他每种因素选择3个水平，按L9（34）正交表进行正交试验，因素水平见表2、正交试验结果见表3、方差分析见表4。

通过直观分析，最佳工艺条件为A2B2C2，方差分析可知，用乙醇浓度对有效成分的含量具有显著性的影响，故A因素选择A2，考虑生产成本，B因素选择B1，故确定A2B1C2为最佳提取工艺优选。该最佳工艺条件与正交试验表中的第4号试验条件相同，从而其合理性得到了试验的验证。

3 讨 论

3.1 考察乙醇回流法提取次数采用的是单因素实验法，结果显示，提取2次与3次提取效果相差不大，综合考虑，确定提取次数为2次。

3.2 预试验时栀子苷的流动相[6]用乙腈-水（15∶85）分离度较好，但有稍许拖尾现象。将栀子苷流动相换成乙腈-0.1%硫酸（15∶85）分离度较好，拖尾现象消失。为了试验方便，将栀子苷与绿原酸流动相合并，改为甲醇-0.1%硫酸（28∶72），结果符合分离度与拖尾因子的要求。

3.3 根据原剂型的使用习惯（用水调敷）以及药物有效成分的性质，本实验对水煎法、乙醇回流法、CO2超流界后药渣用乙醇回流法三种方法进行比较，经多次试验结果表明：乙醇回流法最佳。此实验研究，对实现瘀肿消温度敏感型原位凝胶提取的规范化、产业化有积极的指导意义。

[1]张兆旺.中药药剂学[M].中国中医药出版社,2004：83-93.

[2]韩建伟.《理瀹骈文》中关于中药透皮吸收的理论和认识[J].湖北中医杂志,2006,28(10)：14-15.

[3]Wang Y,Chen M,Ui X,et a1.A hybrid thermo-sensitive chitosan gel for sustained release of Meloxieam[J].J Biomater Sci Polrm Ed,2008,19(9)：1239-1247.

[4]杜广增,赵浩如.Poloxamer 407温敏性即型凝胶的制备和应用进展[J].药学进展,2008,32(4)：163-167.

[5]马廉正,肖学成.原位凝胶研究进展及质量控制要点[J].亚太传统医药,2009,5(3)：141-142.

[6]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：化学工业出版社,2005：173.