丁咯地尔对大鼠坐骨神经嵌压伤后背根神经元凋亡及血管内皮生长因子表达的影响*

苏建华，林 伟，陈玉芳，丁新生，唐金荣，肖 杭，包德诚

1)江苏大学附属金坛医院神经内科金坛213200 2)常州市第四人民医院病理科常州213001 3)南京医科大学第一附属医院神经内科南京210029 4)南京医科大学应用神经毒理研究所南京210029

(2010-04-13收稿 责任编辑 李沛寰)

细胞凋亡的分子机制极其复杂，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)有助于神经元免受低氧和糖缺失的损害，并且能刺激轴突生长和改善背根神经元的存活，从而直接发挥神经保护作用［1-3］。丁咯地尔是一种血管活性药物，能阻滞血管平滑肌肾上腺素能受体兼弱Ca2+拮抗作用［4-5］，其对周围神经损伤后神经元有确切的保护作用［6］。作者建立周围神经嵌压伤动物模型，以丁咯地尔预处理后应用TUNEL法和免疫组织化学SP法检测不同时间点细胞凋亡和VEGF表达的变化，探讨丁咯地尔对周围神经损伤后神经元保护的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器 丁咯地尔(批号021104，南京金陵药业有限公司产品)，免疫组织化学SP试剂盒和DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，TUNEL凋亡试剂盒(武汉博士德公司产品)，其他试剂为国产分析纯。常规神经分离设备一套由东南大学医学院解剖学教研室提供。

1.2 大鼠周围神经嵌压伤动物模型的建立 参照Patro等［7］的方法制作周围神经嵌压伤动物模型:大鼠用30 g/L戊巴比妥10 mL/kg麻醉，仰卧固定于鼠板上，于右后肢腹股沟处切开皮肤1 cm，钝性分离肌肉组织，显露坐骨神经，挤压坐骨神经，持续30 s，关闭切口，常规注射青霉素预防感染。

1.3 动物分组与处理 SD大鼠84只，SPF级，体质量180～220 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。禁食12 h，分3组，每组28只，雌雄各半。正常组不给药;丁咯地尔组给予丁咯地尔40 mg/(kg·d)，腹腔注射，共 14 d;模型组按 0.8 mL/(kg·d)腹腔注射生理盐水，共14 d，常规饲养。正常组坐骨神经显露后即关闭切口，其余2组大鼠制作周围神经嵌压伤动物模型。

1.4 背根神经节的分离 各组分别于模型制备后6、12、24、48、72、96 h 和 7 d 处死实验大鼠 4 只，参照文献［8］的方法，处死大鼠立即切开背部皮肤，沿脊柱两侧剪断与之相连的肋骨，取出胸腰段脊柱，置于含饱和氧的DMEM液(pH 7.4)培养皿内。然后由脊柱正中剖开椎管从内侧小心分离L1～5背根神经节，置于体积分数10%甲醛溶液中。

1.5 背根神经元凋亡细胞的检测 采用TUNEL法，标记步骤按试剂盒提供的操作手册进行，DAB显色。凋亡细胞呈棕褐色和棕黄色，胞核固缩，颗粒深染。各组各时间点随机抽取4个标本进行检测，每张切片400倍光镜下任取5个视野分别计数相应的细胞凋亡数，取均值。

1.6 背根神经元的VEGF免疫组织化学染色 采用免疫组织化学SP法。载玻片采用APES涂片;切片常规脱蜡至水;体积分数3%H2O2去离子水孵育5～10 min，阻断内源性过氧化酶;对抗原进行热修复;滴加一抗VEGF鼠抗人单克隆抗体(1-150稀释)，4℃冰箱过夜，PBS冲洗3次2 min;滴加山羊抗小鼠IgG抗体-HRP多聚体，室温孵育20～30 min，PBS冲洗3次2 min;DAB显色;自来水冲洗;苏木精复染，脱水透明，封片;400倍镜下观察。VEGF表达以胞质呈褐黄色颗粒为阳性细胞。各组各时间点随机抽取4个标本进行检测，每张切片任取5个视野分别计数相应VEGF阳性表达数，取均值。

1.7 统计学处理 采用SAS 6.12进行分析，各组同一时间点和同一时间点不同组间凋亡细胞数和VEGF阳性表达数的比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 不同时间点各组背根神经元凋亡细胞计数见表1。

2.2 不同时间点各组背根神经元细胞VEGF蛋白的表达 见图1和表2。

表1 不同时间点各组背根神经元凋亡细胞计数(n=4) 个

图1 各组背根神经元VEGF免疫组织化学染色(SP，×400)A:正常组;B:模型组;C:丁咯地尔组。

表2 不同时间点各组细胞VEGF蛋白的表达(n=4) 个

3 讨论

鉴于神经血管构筑及其生理的特点，当某些因素使神经血流量减少，神经组织因缺氧而发生水肿，体积增大，管腔内压力增高，导致神经嵌压加重，造成神经代谢、传导功能障碍而出现临床症状;短期内嵌压不能纠正者，大量的神经轴突会发生变性甚至坏死［9］。Dahlin［10］指出急慢性压迫可引起神经微循环受损，使神经内膜血管通透性增加、束膜下水肿形成、轴浆转运障碍，从而导致神经元死亡。作者的研究结果显示:正常组大鼠背根神经元细胞少见凋亡。模型组在坐骨神经嵌压伤后6 h神经细胞即出现凋亡，24 h继续增多，72 h时达高峰，96 h～7 d凋亡细胞逐渐减少;而丁咯地尔组于模型制备后6 h也开始出现凋亡细胞，但各期凋亡数均较同期模型组减少，提示丁咯地尔可减轻坐骨神经嵌压后背根神经元的病理损伤。

最近研究［2-3，11］认为:VEGF 是促进血管内皮细胞分裂和增殖的有丝分裂源，通过激活内皮细胞上的磷脂酶C短暂地诱导Ca2+释放，对内皮细胞的生长起刺激和趋化作用，在体内可诱导血管生成，直接发挥神经保护作用。新近研究［12-13］也认为:在脊髓损伤，甚至周围神经损伤中，VEGF对神经元均具有神经保护作用。但对其机制尚未达成共识［12，14］。大鼠坐骨神经嵌压伤后，VEGF除正常组轻度表达外，24 h起模型组和丁咯地尔组背根神经元细胞VEGF表达均开始增加，丁咯地尔组于模型制备后48～72 h表达达到高峰，7 d时丁咯地尔组仍有较高表达，其表达的数量较模型组明显增加且持续时间延长。提示丁咯地尔可提高嵌压后大鼠背根神经细胞VEGF的表达。

综上所述，坐骨神经嵌压后背根神经元广泛凋亡，丁咯地尔可通过上调VEGF来抑制坐骨神经嵌压伤后背根神经元凋亡。

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