河南省2010年肠道病毒EV71型分离株全基因组序列分析*

李幸乐，许玉玲，黄学勇，陈豪敏，许汴利

河南省疾病预防控制中心传染病所郑州 450016

#通讯作者，男，1958年3月生，硕士，主任医师，研究方向:流行病与寄生虫病，E-mail:xubl@hncdc.com.cn

河南省2010年肠道病毒EV71型分离株全基因组序列分析*

李幸乐，许玉玲，黄学勇，陈豪敏，许汴利#

河南省疾病预防控制中心传染病所郑州 450016

#通讯作者，男，1958年3月生，硕士，主任医师，研究方向:流行病与寄生虫病，E-mail:xubl@hncdc.com.cn

手足口病;肠道病毒71型;测序;同源性分析

目的:了解2010年河南省流行的肠道病毒(EV)71型基因特征。方法:筛选2010年河南省分离的EV71型病毒株1株(EV71/Henan/DC/2010)，进行全基因组序列测定和基因进化特性分析。结果:EV71/Henan/ DC/2010与其他EV71病毒株相比，编码区无核苷酸的缺失或插入，5’UTR区和3’UTR区长度和序列有一定差异。核苷酸同源性比较显示，EV71/Henan/DC/2010与2008年北京暴发流行株同源性最高(99.2%)，与安徽阜阳暴发流行株和河南省暴发流行株均具有很高的同源性(98.1%和99.1%);与EV71各亚型代表株的比较结果显示，除VP3区以外，EV71/Henan/DC/2010各区均与C4亚型代表株同源性最高;氨基酸同源性比较结果显示，EV71/ Henan/DC/2010大多数核苷酸变异属无义突变，相应氨基酸并未随之发生改变。根据VP1区基因序列构建遗传进化分析树显示，EV71/Henan/DC/2010与C4亚型同属一个分支。结论:EV71/Henan/DC/2010与2008年北京EV71流行株亲缘关系最为接近，同属于C4亚型。与我省及我国既往流行毒株相比，未发生大的变异。

肠道病毒(Enterovirus，EV)71型属小RNA病毒科肠道病毒属成员。自1974年首次报道从美国加利福尼亚州暴发的表现有中枢神经系统症状的患者粪便标本中分离到EV71病毒以来，世界上多个国家和地区相继报道了该病毒的暴发和流行。EV71的感染主要引起手足口病(hand-foot-mouth disease，HFMD)，重症患者可表现为无菌性脑膜炎、脑炎等多种与神经系统相关的疾病［1-2］。1997年马来西亚EV71病毒感染大暴发，随后该病毒感染率在亚洲地区呈逐年上升趋势。2008年3至4月我国安徽省阜阳市发生儿童感染EV71疫情，此后我国大陆各地相继出现EV71疫情，至今一直居高不下。2010年HFMD在河南省仍然呈现大的流行，实验室诊断EV71为主要病原体。该研究对2010年河南分离的1株EV71进行了全基因序列测定，在此基础上进行了详细的全序列分析和进化途径分析，以阐明EV71基因组结构和致病性的关系，为EV71的基础研究和防控策略提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 病毒及来源 该研究所选用的EV71毒株来自2010年河南省疾病预防控制中心全省监测所分离到的毒株，毒株分离自死亡病例的胸水标本。患儿为11个月龄女婴，经临床确诊为HFMD，合并重症心肌炎及肺炎、肺水肿死亡。分别采集患儿粪便、胸水和腹水标本，经RD、Hep-2细胞培养不产生病变，经Vero细胞分离培养自胸水得到病毒，RT-PCR方法鉴定为 EV71型，命名为 EV71/Henan/DC/ 2010。

1.2 实验试剂 病毒基因组RNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，TaKaRa RT-PCR试剂盒购自大连宝生物工程有限公司，UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司。其他试剂均为分析纯。

1.3 引物设计与合成 参照文献［3］，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成全基因组测序用引物。

1.4 病毒cDNA的获取和PCR扩增 根据天根试剂盒操作说明提取病毒基因组RNA，根据TaKaRa试剂盒说明利用随机六聚体引物获取病毒cDNA。以cDNA为模板，PCR扩增EV71特异片段。扩增条件为94℃预变性5 min;94℃变性30 s，50℃退火40 s，65℃延伸40 s，35个循环;65℃延伸10 min。

1.5 病毒基因组序列测定和分析 将以上12对引物及PCR阳性产物送南京金斯瑞生物科技有限公司测序，测序结果采用DNAStar 7.0编辑，同时采用DNAStar 7.0、CLUSTALX 1.81和Mega 4.0进行序列比较分析，RNA Sturcture 4.6软件用于5’非编码区(5’UTR)RNA二级结构预测。EV71参比毒株均取自GenBank［3-5］，所选取 EV71参考毒株的基因型、名称和序列号如下。A:BrCr(U22521);B:MS/ 7423/87(U22522);C1:PLday1/CH/06(EU414335)，0389-MAA-00(AY207626);C2:1245a/98/tw(AF176044)，2912-TAI-98(AF286522);C3:KOR-EV71-02(AY125967)，KOREV71-07(AY125971);C4:SHZH98(AF302996); 2008北京EV71流行株:BJO8-Z011-4(FJ606448); 2008安徽EV71流行株:Fuyang/17.08/2(EU703813); 2008河南EV71流行株:HENAN08(GU366191);脑炎株:TW984(DQ133458);轻症株:Zhejiang08 (EU864507)。

2 结果

2.1 EV71病毒基因组结构特点 对12对PCR扩增产物均采用双向重叠测序，以确保数据准确性。12个首尾相互重叠的PCR片段覆盖了除Ploy(A)尾之外的整个基因组。核苷酸序列测定结果显示，EV71/Henan/DC/2010株全基因组［未包括 Poly (A)尾］长度为7 406 bp，其中A占27.21%，G占23.90%，C占23.86%，U占25.03%。腺嘌呤核苷酸和胸腺嘧啶核苷酸丰富(A+T=52.24%)。从基因组的5’端开始有743个碱基的非编码区(5’UTR)，与BrCr株相同。5’UTR之后为6 579 bp的编码区，编码含2 193个氨基酸的多聚蛋白，其后为81个碱基的3’UTR。与其他 EV71毒株相比，EV71/Henan/DC/2010在编码区没有核苷酸的缺失和插入。

2.2 病毒基因组核苷酸序列分析

将EV71/Henan/DC/2010株序列与EV71原型株BrCr、各亚型代表株、CA16 G-10以及2008年北京流行株、安徽流行株和河南省流行株序列进行比较，核苷酸同源性见表1。

EV71/Henan/DC/2010株全基因序列与 BrCr (基因型A)的同源性为85.4%，与MS/7423/87(基因型B)的同源性为87.1%，与基因型C的同源性为87.3%～94.2%。与北京、安徽、河南2008年流行株的同源性分别为99.2%、98.1%和99.1%，与CA16 G-10的同源性为72.7%。

在整个基因组的5’UTR区、P1编码区(VP2、VP3和VP1区)、P2编码区、P3编码区和3’UTR区，EV71/Henan/DC/2010株均与北京2008年流行株同源性最高，在VP4区和安徽2008年流行株同源性最高;与EV71各亚型代表株比较，除VP3区与1245a/98/tw(C2代表株)同源性最高外，其余各个区域均与SHZH98(C4代表株)同源性最高;而在整个基因组，EV71/Henan/DC/2010株均与CA16 G-10同源性最低。

二级结构预测结果见图1。根据配对碱基数目、位置可以看出，BrCr、TW984和Zhejiang08株中TW984稳定性最好，Zhejiang08株的稳定性最差。与这3株相比，EV71/Henan/DC/2010该区域的二 级结构与Zhejiang08株完全相同，稳定性一致。

表1 EV71/Henan/DC/2010株与其他EV71毒株核苷酸同源性比较结果 %

图1 EV71 5’UTR(第453～561位碱基)二级结构预测图

2.3 病毒基因组氨基酸序列分析 EV71/Henan/ DC/2010株病毒基因组编码区全长6 579个核苷酸，编码2 193个氨基酸。EV71/Henan/DC/2010株与其他EV71毒株氨基酸同源性比较结果，见表2。EV71/Henan/DC/2010株编码区氨基酸序列与BrCr(基因型A)的同源性为94.6%，与MS/7423/ 87(基因型B)的同源性为95.5%，与基因型C的同源性为95.5%～96.0%。与北京、安徽、河南2008年流行株的同源性分别为 99.5%、99.5%和98.9%。结果显示大多数核苷酸变异属无义突变，相应氨基酸并没有发生改变。在结构蛋白P1区，包括VP4、VP2、VP3和VP1区，EV71/Henan/DC/2010株与CA16的同源性最低，与EV71各基因型同源性都较高，其中VP4的同源性均为100.0%;在非结构蛋白P2区，EV71/Henan/DC/2010株与CA16的同源性较高，与MS/7423/87株(B型代表株)同源性最低;在非结构蛋白P3区，EV71/Henan/DC/2010株也与CA16株同源性较高，与PLday1/CH/06株(C1型代表株)同源性最低。

表2 EV71/Henan/DC/2010株与其他EV71毒株氨基酸同源性比较结果 %

2.4 病毒基因遗传进化分析 根据VP1区核苷酸序列分析构建进化树，见图2。结果显示，EV71/ Henan/DC/2010株与2008北京分离株、安徽阜阳株和河南分离株同属C4亚型;与核苷酸同源性比较结果一致。

图2 EV71病毒VP1区的遗传进化分析树

3 讨论

该研究选取了2010年河南省HFMD流行期间的一个死亡病例分离株作为研究对象。与大多数EV71毒株不同:取该病例的标本直接进行PCR以及RT-PCR，显示为PE阳性，EV71阴性。病毒在RD和Hep-2细胞不产生病变，在Vero细胞上有连续稳定病变出现，经鉴定为EV71毒株。对该毒株进行全基因组序列的测定和分析，结果表明，EV71/ Henan/DC/2010株与其他EV71毒株有着相同的基因结构。

5’UTR区第453～561位碱基(以国际标准株BrCr为准)与 Polio病毒内部核糖体进入位点(IRES)第Ⅴ区结构域相对应。该区域同Polio病毒毒力密切相关。EV71病毒与Polio病毒同属微小RNA病毒科肠道病毒属，病毒结构高度类似［4-6］，为探索EV71/Henan/DC/2010毒力，利用RNA Structure软件对肠道病毒EV71型的相同位点进行二级结构预测。结果显示，尽管EV71/Henan/DC/2010毒株致患儿死亡，但其与来自轻症病例的 Zhejiang08株在该区域的二级结构完全一致，稳定性相同。可以排除该位点变异导致病毒毒力增强进而导致的患儿死亡。

对EV71病毒VP1区核苷酸序列进行分析，结果显示EV71/Henan/DC/2010为C4亚型，与2008北京、河南、安徽三地流行株都具有相当高的同源性，提示EV71病毒株目前相对稳定，没有发生大的变异。EV71/Henan/DC/2010尤其与 2008北京EV71流行株的同源性最高，分析原因可能如下:河南为人口大省，每年有大量人口输出至北京，且郑州和北京同为重要的交通枢纽，人口来往密集频繁，病毒在两地之间的传播快。河南EV71致死株与2008年北京流行株的高度同源性提示人口流动在EV71病毒传播中的重要性。

对EV71/Henan/DC/2010株的上述研究表明，EV71/Henan/DC/2010株从5’UTR区、VP1区和全基因序列上与我国目前分离到的EV71毒株无显著不同，毒力也没有显著变化。针对 EV71/Henan/ DC/2010株致患儿死亡，分析原因可能如下:病毒毒力增加，宿主自身的因素。宿主生活习惯、免疫水平差异等都会影响病毒的作用。该研究结果从分子水平上暂时没有发现导致病毒毒力增强的因素，因此更倾向认为此次致死来自于宿主自身的因素。同时也应该认识到，病毒毒力的影响因素在病毒基因组中并非由单一位点决定，而是由多个位点共同决定的，由于来源于死亡病例的EV71全基因序列较少，短时间内尚不能得到致死EV71毒株分子水平的共性。这还有待于长期的监测和研究，获取大量毒株进行比对分析。

［1］Lee TC，Guo HR，Su HJ，et al.Diseases caused by enterovirus 71 infection［J］.Pediatr Infect Dis J，2009，28(10): 904

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［3］黄学勇，陈豪敏，马宏，等.2009年河南省肠道病毒71型基因组特征分析［J］.中国预防医学杂志，2010，11 (7):675

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Complete sequence analysis of Enterovirus 71 strain from a fatal case of hand-foot-mouth disease during an epidemic of Henan province in 2010

LI Xingle，XU Yuling，HUANG Xueyong，CHEN Haomin，XU BianliInfectious Disease Institute，Henan Provincial Center for Disease Control and Prevention，Zhengzhou 450016

hand-foot-mouth disease;Enterovirus 71;sequencing;homology analysis

Aim:To investigate the genetic characteristics of Enterovirus 71(EV71)circulating strains of Henan province in 2010.Methods:The EV71 strain isolated from a fatal case of hand-foot-mouth disease during an epidemic of Henan in 2010 was chosen.Its complete genome was sequenced and analyzed comparatively.Results:The results showed that EV71/Henan/DC/2010 had no insertion or deletion detected in the coding region but several insertions and deletions in 5’and 3’UTR.Phylogenetic analysis of EV71/Henan/DC/2010 and reference strains showed it had the highest nuclyeotide homology with 2008 Beijing epidemicstrain FJ606448(99.2%)，and with Anhui epidemicstrain EU703813 and Henan epidemicstrain GU366191(98.1%and 99.1%).The majority nucleotide variations were nonsensemutation，and the corresponding amino acid did not change along with it.In all but VP3 regions，EV71/Henan/DC/2010 had the highest nucleotide homology with C4 subtype.It clustered with reference strains of C4 subtype in the phylogenetic tree.Conclusion: EV71/Henan/DC/2010 strain has the nearest genetic relationship with 2008 Beijing epidemicstrain FJ606448，both belong to the C4 subtype.EV71/Henan/DC/2010 strain has not remarkable variation.

R183.4

*河南省医学科技攻关基金资助重大项目 201001015

(2010-12-23收稿 责任编辑姜春霞)