香菇C91-3菌丝发酵液蛋白口服液抗肿瘤免疫机制的探讨

钟民涛，王晓丽，刘颖丽，刘 磊，李星云，张 伟，黄 敏

(大连医科大学微生物学教研室，辽宁大连 116044)

香菇C91-3菌丝发酵液蛋白口服液抗肿瘤免疫机制的探讨

钟民涛，王晓丽，刘颖丽，刘 磊，李星云，张 伟，黄 敏

(大连医科大学微生物学教研室，辽宁大连 116044)

［目的］探讨香菇C91-3菌丝发酵液蛋白(LFP91-3)口服液的抑制肿瘤作用及机制。［方法］取60只昆明小鼠，随机分6组后进行S180荷瘤，并对荷瘤小鼠分别给予蒸馏水和不同剂量的LFP91-3口服，观察剂量对小鼠生存期的影响，确定LFP91-3的最适剂量。同时观察口服最适剂量后荷瘤小鼠淋巴细胞增殖反应，血清IL-2和TNF-α含量的变化，以蒸馏水口服组为对照。［结果］LFP91-3口服液能延长荷瘤小鼠的生存期，且存在一定的剂量依赖关系。LFP91-3最适剂量组小鼠淋巴细胞增殖率，血清 IL-2和 TNF-α水平分别为(44.11±14.4)%，(48.33±16.7)pg/mL 和(84.27±16.88)pg/mL，明显高于对照的蒸馏水组(18.04 ±8.72)%，(30.5 ±3.58)pg/mL 和(35.05±17.29)pg/mL，P＜0.05。［结论］LFP91-3口服液具有体内抑瘤作用，其抑瘤作用可能与机体免疫能力提高有关。

香菇发酵蛋白;抗肿瘤;IL-2;TNF-α

香菇又名香蕈或香椹，是名贵的食药用菌之一，国内外对香菇多糖已有许多研究，认为其具有抗病毒、抗肿瘤、抗感染、免疫调节和刺激干扰素形成等作用。目前，已经开发出多种香菇多糖药片和药剂应用于临床，配合手术、化疗和放疗可以提高疗效，延长病人生存期［1-3］。香菇已被列为国内重点研究的抗癌资源植物之一。

香菇C91-3菌株为黄敏等多年筛选的一株真菌，经过生物发酵培养后，其发酵液具有明显抗肿瘤作用［4-5］。香菇 C91-3菌丝发酵液蛋白(LFP91-3)是对香菇C91-3菌丝发酵液进行初步提取获得的混合蛋白，抗肿瘤实验发现其具有体外直接杀伤肿瘤作用，在体内抑制肿瘤生长，但给药途径是腹腔注射给药［6-8］。因此本研究改善给药途径，进一步对LFP91-3口服液效果进行研究，为今后研制有效的抗肿瘤新药提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 实验动物:纯系昆明小鼠，体重18～22 g，6～8周龄，雌雄各半(大连医科大学实验动物中心提供)。

1.1.2 香菇 C91-3菌丝:香菇 C91-3菌株由大连理工大学食用菌研究中心惠赠。

1.1.3 瘤 株:S180(小鼠腹水型肉瘤细胞株)由本教研室提供。

1.1.4 主要试剂:RPMl-1640:GIBCO U.S.A;小牛血清:杭州四季青生物工程材料研究所;刀豆蛋白(ConA):中国医药(集团)上海化学试剂公司;四甲基偶氮唑兰(MTT):北京华美生物工程公司;IL-2和TNF-α的ELISA试剂盒:武汉博士德生物工程有限公司;依多灵香菇菌多糖片(福建省闽东力捷迅药业有限公司出品)。

1.1.5 主要仪器:真空干燥机(大连医科大学中心实验室提供);CO2孵育培养箱(Thermo公司);酶标仪(BioRAD)。

1.2 方 法

1.2.1 LFP91-3的制备:香菇菌丝体发酵后收集发酵液，发酵液经离心、盐析、透析除盐及浓缩，具体方法参照文献［8］，最后制成口服液。

1.2.2 S180荷瘤小鼠模型的建立，动物分组和给药:S180肿瘤细胞连续在昆明小鼠腹腔传代两代以上，选传代后6～7 d的小鼠，腹腔抽取腹水瘤细胞，Hanks液洗2次，调整细胞数至5×107/mL。取60只昆明小鼠，0.2 mL/只于小鼠腹腔接种肿瘤细胞。荷瘤小鼠分别于建模24 h随机分成6组:蒸馏水组、环磷酰胺(CTX)组、香菇多糖(LNT)组、香菇C91-3菌丝发酵液蛋白(LFP91-3)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组。每组10 只，荷瘤24 h 后分别予蒸馏水、CTX 0.6 mg、LNT 0.1 mg、LFP91-3125、250、500 μg，每次 0.5 mL/只，在第 1、3、5、7、9、11、13、15 天灌胃给药，共计 8 次，分别观察6组荷瘤小鼠的生存期，探讨香菇LFP91-3的最适剂量。

1.2.3 荷瘤小鼠免疫功能指标的测定:另取20只昆明小鼠，建模方法同上，荷瘤后随机分为两组:蒸馏水组、LFP91-3最适剂量组。每组10只，荷瘤24 h后分别予蒸馏水、LFP91-3最适剂量，每次 0.5 mL/只，给药时间同上。于接种肿瘤细胞后第16天处死小鼠，各组小鼠分别摘除眼球取血，之后脱颈处死取脾进行下一步实验。

(1)淋巴细胞增殖反应实验:各组小鼠脱颈处死后，无菌取脾，放入Hanks液中剪成糊状(组织研磨器)，200目不锈钢网(细胞网)过滤分成单个脾细胞，无菌三蒸水休克Rbc 30 s，加等量体积1.7%无菌NaCl恢复等渗，加入5 mL Hanks液中，离心1500 r/min，10 min，弃上清，加 2 ～3 mL RPMl-1640 液1500 r/min离心5 min，洗2次后悬于培养液中，台盼蓝染色法判断细胞活性在95%以上，调整浓度为5×106/mL。采用MTT比色法测定淋巴细胞增殖反应［9］。

(2)血清IL-2和TNF-α含量的测定:将各组小鼠摘取的眼球血离心，制备血清。用小鼠IL-2和TNF-α的ELISA检验试剂盒，按试剂盒上的说明书操作。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 LFP91-3口服液对荷瘤小鼠生存期的影响

如表1所示，CTX组、LNT组和 LFP91-3组均能显著延长S180肿瘤细胞所致腹水型荷瘤小鼠的存活时间，与蒸馏水组比较差异具有显著性意义(P＜0.05);LFP91-3Ⅰ组与CTX组的存活时间比较差异无显著性意义(P ＞0.05);LFP91-3Ⅱ、Ⅲ组的存活时间均长于CTX组和LNT组(P＜0.05)，且荷瘤小鼠的存活时间在适宜范围内随LFP91-3浓度的增大而延长，存在一定的剂量依赖关系。从而确定LFP91-3最适剂量为 LFP91-3500 μg。

表1 LFP91-3对S180荷瘤小鼠生存期的影响Tab 1 Effect of LFP91-3on life span in mice bearing S180 tumors

2.2 LFP91-3对荷瘤小鼠淋巴细胞增殖率、血清IL-2和TNF-α含量的影响

荷瘤小鼠淋巴细胞增殖率的测定结果见表2。LFP91-3最适剂量组小鼠的淋巴细胞增殖率明显高于蒸馏水组(P ＜0.05)。而且，LFP91-3最适剂量组小鼠的IL-2和TNF-α含量与蒸馏水组比较，差异也有显著性意义(P ＜0.05)，LFP91-3最适剂量组均高于蒸馏水组。

3 讨 论

肿瘤传统的治疗方法有肿瘤切除手术、放疗和化疗，但给病人机体造成极大损伤，特别是对免疫系统的影响，往往会导致肿瘤细胞逃避机体的免疫监视而形成扩散或复发。免疫状态低下是恶性肿瘤的重要生物学特征之一，香菇多糖虽已被证明具有抗肿瘤作用，并且是通过刺激机体免疫系统增强其免疫功能来达到间接抗肿瘤的目的，但其能否直接杀伤肿瘤细胞还尚未有定论［10-11］。目前临床上应用香菇多糖(如天地欣等)作为辅助药物参与肿瘤治疗，有助于术后恢复［12］。环磷酰胺属于临床的化疗药物，虽能杀伤肿瘤细胞，但是其副作用大，并导致机体免疫功能低下。因此，在癌症的治疗中找到一种既杀伤肿瘤细胞又重建或增强机体免疫功能的药物具有相当重要的意义［13］。

表2 LFP91-3对S180荷瘤小鼠淋巴细胞增殖率、血清IL-2和 TNF-α的影响Tab 2 Effect of LFP91-3on lymphocyte proliferation，serum concentration of IL -2 and TNF- α within mice bearing S180 tumor

香菇C91-3菌丝发酵液蛋白(LFP91-3)已被证实具有体外直接杀伤肿瘤的作用，在体内可抑制肿瘤生长，但给药途径是腹腔注射给药［8］。因临床上口服给药能显著提高癌症患者的生活质量，且剂型易于制备，成本较低，使用时无需特殊护理，具有方便和经济的优点。因此，本实验选用LFP91-3口服液对S180细胞荷瘤小鼠的抑瘤效果及其抗肿瘤机制进行探讨，结果发现香菇C91-3菌丝发酵液蛋白经口服给药后可明显延长S180荷瘤小鼠生存时间，抗肿瘤效果与香菇多糖和环磷酰胺无明显差异，且荷瘤小鼠的存活时间在适宜范围内随LFP91-3浓度的增大而延长，存在一定的剂量依赖关系。同时，香菇菌丝发酵液蛋白LFP91-3口服后还能促进荷瘤小鼠脾脏淋巴细胞对ConA的增殖反应，而且增加了IL-2和TNF-α的分泌。IL-2是由活化的T细胞产生的细胞因子，同时IL-2又可活化T和B细胞，参与细胞免疫功能。TNF-α能诱导B淋巴细胞的增生和分化，产生肿瘤特异性抗体，从而产生抗体介导的体液免疫抗瘤效应;同时，TNF-α能诱导B淋巴细胞分泌细胞因子激活巨噬细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞，并协同刺激T细胞增殖从而参与免疫调节，同时，淋巴细胞增殖反应也是反映机体免疫功能的有效指标［14-15］。提示 LFP91-3口服液抗肿瘤作用机制是通过调节和增强机体免疫功能达到对肿瘤的抑制作用，至于LFP91-3口服后有没有直接杀伤肿瘤作用，还有待深入研究。

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［1］芦殿荣，祝彼得，刘啸，等.香菇多糖的免疫调节及临床应用研究进展［J］.中华临床医学杂志，2004，5(7):63-64.

［2］李瑁，钟耀广，刘长江.香菇多糖生物活性的应用与研究进展［J］.现代农业科技，2008，(23):116 -117.

［3］胡建兵，邬洪梁，管丽莉.香菇多糖(天地欣)对胃癌化疗患者红细胞免疫功能的影响［J］.湖南中医药导报，2003，9(3):49 -50.

［4］黄敏，宁安红，张卓然，等.香菇C91-3菌发酵液小鼠体内外抗肿瘤作用的研究［J］.中国微生态学杂志，1996，8(3):38-40.

［5］董晓宇，刘庆平，曹婧，等.香菇C91-3菌丝发酵液蛋白抗肿瘤免疫机制［J］.肿瘤学杂志，2006，1(12):64 -66.

［6］王晓丽，赵越，李星云，等.香菇C91-3发酵液蛋白的初步分离及其体外抗肿瘤作用检测［J］.山东医药，2009，49(45):73-74.

［7］赵越，黄敏，王晓丽，等.香菇C91-3菌丝发酵液蛋白LFP91-3C小鼠体内抗肿瘤免疫机制研究［J］.中国微生态学杂志，2009，21(3):226 -228.

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［9］李星云，黄敏，钟民涛，等.香菇蛋白LFP91-3-A的分离纯化及其抗肿瘤机制［J］.中华微生物学和免疫学杂志，2007，27(9):842.

［10］刘栋，钱建亚，卜敏.香菇多糖抗肿瘤作用研究现状［J］.中国食用菌，2003，22(2):37 -38.

［11］景军.香菇多糖对人体作用的研究与应用［J］.中国食品卫生杂志，2001，13(2):46 -47.

［12］王林波，陈文军，潘滔，等.天地欣影响消化道恶性肿瘤微转移的初步研究［J］.中华肿瘤杂志，2004，26(8):504-505.

［13］Ooi VE，Liu F.Immunomodulation and anticancer activity of polysaccharide protein complexes［J］.Curr Med Chem，2000，7(7):715 -729.

［14］古翠萍，张沂平.TNF-α抗肿瘤作用机制新进展［J］.中国肿瘤，2007，16(2):102-105.

［15］McFarlin BK，Flynn MG，Hampton T.Carbohydrate consumption during cycling increases in vitro NK cell responses to IL -2 and IFN -gamma［J］.Brain Behav Immun，2007，21:202 -208.

Anti- tumor effect of proteins from lentinus edodes C91-3mycelium's fermentative liquid in vivo

ZHONG Min -tao，WANG Xiao-li，LIU Ying-li，LIU Lei，LI Xing-yun，ZHANG Wei，HUANG Min
(Department of Microbiology，Dalian Medical University，Dalian116044，China)

Abstract:［Objective］The anti- tumor mechanism of oral protein liquid from C91-3lentinus fermentative liquid(LFP91-3)was studied in this experiment.［Methods］Sixty mice in the S180 tumor models were randomly divieded into 6 groups and then were orally given LFP91-3in different doses and water as control to research the effects of LFP91 -3 liquid，on survival and find the optimal dose of the drug.Then lymphocyte proliferation，and serum content changes of IL -2 and TNF-α of the mice in the optimal dose group were observed in comparison to those in water group.［Results］Oral LFP91-3liquid could prolong the survival time of mice in the S180 tumor models，the spleen lymphocyte proliferation rate and serum IL - 2 and TNF - α concentrations of the group with optimal dose of LFP91-3were(44.11 ± 14.4)%，(48.33 ±16.7)pg/mL，(84.27 ±16.88)pg/mL，respectively，being higher than those of group with water(18.04 ±8.72)%，(30.5 ±3.58)pg/mL，(35.05 ±17.29)pg/mL，(P＜0.05).［Conclusion］Oral LFP91-3liquid have potentiality to inhibit cancer，which maybe associate with immunity increasing effect of the drug.

Key words:lentinus edodes fermentative protein(LFP);anti-tumor;IL-2;TNF-α

R730.5

A

1671-7295(2011)06-0551-03

2011-06-22;

2011-09-26

钟民涛(1978-)，辽宁大连人，讲师，博士研究生。

黄 敏，教授，博士生导师。E-mail:huangminchao@163.com