大黄黄连泻心汤、理中丸对消炎痛型及水浸应激型胃溃疡寒热证模型大鼠胃组织EGF、TGF－α含量的影响

李冀，谢田，于海，蒋蕾，赵伟国，赵雪莹，毕珺辉，柴剑波

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

消化性溃疡(PU)包括胃溃疡(GU)和十二指肠溃疡(DU)，因其形成与胃酸/胃蛋白酶的消化作用有关而得名。中医学在治疗消化性溃疡方面积累了大量宝贵的经验，在临床治疗中取得满意的疗效。但现代医学手段研究中医药的模式，缺乏中医理论的精髓要素，难以揭示中医药辨证论治的内涵。证是中医学特有的概念，对于证本质的研究被认为是中医药现代化发展的关键问题，随着研究的日趋深入许多新的理论方法被应用于研究之中，病证结合和方证相关(相应)思想逐渐从临床融入基础研究领域，并为中医证的研究及中医现代化研究提供新的途径。

本研究主要以病证结合和方证相关思想为基础，采用国内外较为公认的水浸应激型和消炎痛型消化性溃疡模型，结合寒热因素，建立消化性溃疡寒、热模型，并通过酶联免疫方法探究寒性方剂大黄黄连泻心汤、热性方剂理中丸对消炎痛型及水浸应激胃溃疡寒热证模型大鼠胃组织中EGF和TGF－α含量的影响。课题组前期实验亦取得显著成果［1－3］。

1 实验材料及药物制备

1.1 实验动物 清洁级Wistar大鼠，黑龙江中医药大学药物安全性评价中心(GLP)，合格证号SCXK(京)2007－0001。

1.2 实验用药 热因素:辣椒水、乙醇混悬液。将辣椒粉过120目筛，溶入60%无水乙醇中，配制成8%干辣椒粉的乙醇混悬液。寒因素:氢氧化钠(NaOH)，电子天平称取6g白色颗粒状NaOH，溶入500mL双蒸水中，配成0.3mol/L浓度。冰水:冷冻保存，使用时提前取出溶化。大黄黄连泻心汤、理中丸均按原方药量及比例制备，其中，大黄黄连泻心汤浓缩至每毫升含0.5g生药量，理中丸浓缩至每毫升含1g生药量的液体，冰箱存储备用。

1.3 主要仪器设备

Sgnergy HT全自动酶标仪(Anthos Labtee instruments made in Austria);PL202－S/00型电子天平(上海梅特勒－托利多仪器有限公司)。

1.4 实验试剂 甲醛(分析纯，天津市博大化工有限公司);医用酒精(黑龙江华润酒精有限公司);乙醚(分析纯级，上海化学试剂采购供应站);盐酸(上海化学试剂采购供应站);生理盐水(哈药集团制药六厂);冰乙酸(上海化学试剂采购供应站);NaOH(天津市博大化工有限公司);TGF－α试剂盒(美国RD公司);EGF试剂盒(美国RD公司)。

2 实验方法

2.1 模型制备及分组给药 将各组动物分别按上述胃寒、热证造模方法［4］，进行寒热因素灌胃，给予相应造模剂;模型组及空白对照组则给予等体积生理盐水，连续7天。寒热因素造模后，将第一步中受试大鼠(除空白对照组)，在各自组别内再按体重随机分成3组，每组10只，即:

寒水(消)组分为:寒水(消)组、寒水(消)大组、寒水(消)理组;

热水(消)组分为:热水(消)组、热水(消)大组、热水(消)理组;

单寒组分为:单寒组、单寒大组、单寒理组;

单热组分为:单热组、单热大组、单热理组。

按组别，各给药组分别给予相应治疗方剂，大黄黄连泻心汤剂量1.8g/kg，理中丸剂量3.6g/kg每天2次;单水(消)组、热水(消)组、寒水(消)组、单热组、单寒组及空白对照组给予等体积生理盐水，连续4天;末次给药后将受试大鼠禁食不禁水30h(注意勿使动物食入粪便和垫料等杂物，以免影响造模结果)，并于消炎痛及水浸应激造模开始前30min，再给药1次。

2.2 取材 分别于消炎痛腹腔注射7h后，水浸应激7h后，处死动物，准确称取大鼠胃组织0.3～0.4g，按重量体积比，加9倍的生理盐水制成10%的匀浆，2 500r/min离心10min，取上清，－20℃冻存备用。

2.3 测定 大鼠胃组织中EGF和TGF－α的含量测定按照试剂盒说明书进行。

3 统计学处理

所有数据通过SPSS 13.0软件包用单因素方差分析(one－way ANOVA)LSD或S－N－K法进行两两比较检验，用(±s)表示结果。

4 实验结果

4.1 寒热方剂对水浸应激型胃溃疡大鼠胃组织EGF和TGF－α含量的影响 结果见表1～3。

表1 水浸应激型胃溃疡寒、热证模型间大鼠胃组织EGF和TGF－α含量的影响(±s)

表1 水浸应激型胃溃疡寒、热证模型间大鼠胃组织EGF和TGF－α含量的影响(±s)

注:与空白组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01，与寒水组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01，与热水组比较，★P＜0.05，★★P＜0.01。

组别 n EGF(pg·mL －1) TGF － α(pg·mL －1)寒水 8 24.31 ±6.66＊＊ 33.24 ±12.43＊＊10 46.16 ±11.20 73.15 ±14.89热水 9 23.19 ±9.18＊＊ 10.98 ±4.04＊＊单寒 10 32.01 ±5.67＊＊△ 58.45 ±17.92△△单热 10 30.17 ±3.96＊＊★ 56.64 ±20.61★★单水 10 33.08 ±10.05＊△★ 51.83 ±20.93＊△★★空白

表2 寒热方剂对水浸应激型胃溃疡寒、热证大鼠胃组织EGF和TGF－α含量的影响(±s)

表2 寒热方剂对水浸应激型胃溃疡寒、热证大鼠胃组织EGF和TGF－α含量的影响(±s)

注:与寒水组比较，△△P ＜0.01，与热水组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

组别 n EGF(pg·mL－1) TGF － α (pg·mL－1)寒水 8 24.31 ±6.66 33.24 ±12.43＊＊8 21.95 ±2.58 15.51 ±5.91寒水大 7 20.95 ±4.58 28.94 ±5.83寒水理 9 43.94 ±17.88△△ 69.29 ±29.14△△热水 9 23.19 ±9.18 10.98 ±4.04热水大 8 34.74 ±11.93* 64.33 ±12.78＊＊热水理

由表1可知:在EGF方面，各模型组与空白组比较EGF含量均明显下降，有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01);寒水与单水、单寒比较有显著性差异(P＜0.05);热水较单水、单热EGF含量明显下降，有显著性差异(P＜0.05)。在TGF－α方面，寒水、热水、单水与空白组比较含量明显降低，有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01);寒水与单水、单寒比较有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)，热水与单水、单热比较有显著性差异(P＜0.01)。

从表2可知:在EGF方面，寒水、热水间无明显差异(P＞0.05);经热性方剂理中丸治疗后，寒水理与寒水比较含量明显升高，有显著性差异(P＜0.01);热水大与热水比较含量明显升高，有显著性差异(P＜0.05)。在TGF－α方面，热水含量低于寒水，有统计学意义(P＜0.01);经热性方剂理中丸治疗后，寒水理与寒水比较含量明显升高，有显著性差异(P＜0.01);经寒性方剂大黄黄连泻心汤治疗后，热水大与热水比较含量明显升高，有显著性差异(P＜0.01)。

表3 寒热方剂对水浸应激型胃溃疡单寒、单热证大鼠胃组织EGF和TGF－α含量的影响(±s)

表3 寒热方剂对水浸应激型胃溃疡单寒、单热证大鼠胃组织EGF和TGF－α含量的影响(±s)

注:与单寒组比较，*P＜0.05，与单热组比较，△P＜0.05。

组别 n EGF(pg·mL －1) TGF － α(pg·mL －1)10 32.01 ±5.67 58.45 ±17.92单寒大 8 32.48 ±9.17 54.45 ±16.03单寒理 9 43.68 ±16.44* 62.24 ±11.18单热 10 30.17 ±3.96 56.64 ±20.61单热大 8 39.48 ±10.56△ 68.25 ±8.60单热理单寒8 27.94 ±8.18 67.23 ±13.59

从表3可知:在EGF方面，单寒理与单寒比较含量明显升高，有显著性差异(P＜0.05);经寒性方剂大黄黄连泻心汤治疗后，单热大与单热比较含量明显升高，有显著性差异(P＜0.05)。在TGF－α方面，单寒与单热比较(P＞0.05);经大黄黄连泻心汤和理中丸治疗后，各组差异仍不显著(P＞0.05)。

4.2 寒热方剂对消炎痛型胃溃疡大鼠胃组织EGF和TGF－α含量的影响 结果见表4～6。

表4 消炎痛型胃溃疡寒、热证模型间大鼠胃组织EGF和TGF－α含量的影响(±s)

表4 消炎痛型胃溃疡寒、热证模型间大鼠胃组织EGF和TGF－α含量的影响(±s)

注:与空白组比较，＊＊P ＜0.01;与寒消比较，★P ＜0.05，★★P＜0.01;与热消组比较，#P ＜0.05，##P ＜0.01;与单寒组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。

组别 n EGF(pg·mL －1) TGF － α(pg·mL －1)寒消 9 25.37 ±6.81＊＊ 32.88±9.15＊＊△△10 47.13 ±8.68 72.89 ±11.66热消 9 23.72 ±6.32＊＊ 14.02±4.10＊＊★★单寒 10 32.62 ±7.90＊＊★ 56.18±12.20＊＊单热 9 29.87 ±5.35＊＊# 30.11 ±8.29＊＊△△##单消 9 32.32 ±6.87＊＊★# 52.73 ±12.59＊＊★★##空白

由表4可知:在EGF方面，各组大鼠胃组织EGF含量均明显低于空白组，有极显著性差异(P＜0.01);寒消与单寒、单消，热消与单消、单热比较，EGF含量均明显降低，比较具有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)。在TGF－α方面，各组大鼠胃组织TGF含量均明显低于空白组，有极显著性差异(P＜0.01);寒消与单消、单热比较，热消与单消、单热比较有显著性差异(P＜0.01);热消含量明显低于寒消，有统计学意义(P＜0.01)。

表5 寒热方剂对消炎痛型胃溃疡寒、热证大鼠胃组织EGF和TGF－α含量的影响(±s)

表5 寒热方剂对消炎痛型胃溃疡寒、热证大鼠胃组织EGF和TGF－α含量的影响(±s)

注:与寒消组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与热消组比较，△△P＜0.01。

组别 n EGF(pg·mL－1) TGF － α (pg·mL－1)寒消 9 25.37 ±6.81 32.88 ±9.15△△8 21.59 ±5.77 12.10 ±4.88寒消大 8 22.59 ±7.29 30.60 ±8.44寒消理 8 40.72 ±4.32＊＊ 62.90 ±11.98＊＊热消 9 23.72 ±6.32 14.02 ±4.10热消大 8 38.41 ±4.29△△ 59.69 ±11.87△△热消理

由表5可知:在EGF方面，经寒性方剂大黄黄连泻心汤治疗后，热消大与热消比较含量明显升高，有显著性差异(P＜0.05)。寒消大与寒消、热消理与热消各组比较，胃组织 EGF含量无显著性差异(P＞0.05)。在TGF－α方面，寒消与热消比较TGF含量明显升高，有显著性差异(P＜0.05);经热性方剂理中丸治疗后，寒消理与寒消比较含量明显升高，有显著性差异(P＜0.01);经寒性方剂大黄黄连泻心汤治疗后，热消大与热消比较含量明显升高，有显著性差异(P＜0.01)。

表6 寒热方剂对消炎痛型胃溃疡单寒、单热证大鼠胃组织EGF和TGF－α含量的影响(±s)

表6 寒热方剂对消炎痛型胃溃疡单寒、单热证大鼠胃组织EGF和TGF－α含量的影响(±s)

注:与单热组比较，★P＜0.05，★★P＜0.01;与单寒组比较，△△P＜0.01。

组别 n EGF(pg·mL －1) TGF － α(pg·mL －1)9 27.77 ±7.20 27.17 ±8.90 10 32.62 ±7.90 56.18 ±12.20单寒大 9 30.36 ±6.68 54.57 ±14.79单寒理 9 42.99 ±6.18△△ 67.33 ±10.52△单热 9 29.87 ±5.35 30.11 ±8.29△△单热大 9 37.83 ±9.29★ 59.30 ±8.20★★单热理单寒

由表6可知:在EGF方面，经热性方剂理中丸治疗后，单寒理与单寒比较EGF含量均明显升高，具有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01);经寒性方剂大黄黄连泻心汤治疗后，单热大与单热比较含量明显升高，有显著性差异(P＜0.05)。在TGF－α方面，单寒与单热比较TGF－α含量明显升高，具有显著性差异(P＜0.01);经热性方剂理中丸治疗后，单寒理与单寒比较含量明显升高，有显著性差异(P＜0.05);经寒性方剂大黄黄连泻心汤治疗后，单热大与单热比较含量明显升高，有显著性差异(P＜0.01)。

5 讨论

溃疡愈合是一个十分复杂的过程，受多种因子及其受体的调控，关系密切的细胞因子是转化生长因子α(TGF－α)、血管内皮生长因子等。EGF可以抑制胃酸分泌，增加胃黏膜血流量，增加黏膜DNA合成，促进胃黏膜上皮细胞增殖而进行细胞保护［5］。TGF－α产生于整个胃肠道，尤以胃窦黏膜表达量高，参与胃肠道调节黏膜上皮的更新和黏膜损伤的修复，是维持黏膜完整性的重要介质，被称为“黏膜完整肽”［6］。动物实验表明:大鼠胃溃疡在愈合过程中，TGF－α、EGF两种生长因子的表达是逐渐增强的，也就是说大鼠胃溃疡的愈合与两种生长因子的表达是一致的。其中TGF－α对调控局部胃结构的重建起决定性作用［7］。

本研究表明，水浸应激型胃溃疡寒、热证造模皆可使胃黏膜中EGF、TGF－α含量减少，容易导致应激型溃疡复发;施加寒、热因素对EGF影响不明显;TGF－α在应激型溃疡热证上反应明显，说明应激型溃疡热证可能使胃黏膜完整性的破坏程度加重，应激型溃疡的愈合能力降低。消炎痛型胃溃疡寒、热证造模皆可使胃黏膜中EGF、TGF－α含量减少，但施加热因素后TGF－α含量明显降低，提示TGF－α可作为临床胃溃疡热证的微观指标。寒性方剂大黄黄连泻心汤预防水浸应激型溃疡热证的作用机制可能与刺激胃黏膜EGF、TGF－α释放有关;对消炎痛型胃溃疡热证模型有选择性，升高EGF、TGF－α含量可能是大黄黄连泻心汤治疗胃溃疡热证的作用机制。热性方剂理中丸预防水浸应激型溃疡寒证作用机制可能与刺激胃黏膜EGF、TGF－α释放有关;治疗消炎痛型胃溃疡寒证的作用机制可能与刺激胃粘膜EGF、TGF－α释放，从而升高EGF TGF－α含量有关，体现了方证相应的证治规律。

综上所述，通过寒热不同性质的方剂对施加寒热因素的消炎痛型和水浸应激型胃溃疡模型大鼠胃组织中EGF和TGF－α含量影响的比较，说明通过“方证相应”理论验证“病证结合”的胃溃疡寒热模型复制成功，大黄黄连泻心汤可以治疗热性消炎痛型胃溃疡，预防热性水浸应激型胃溃疡的形成;理中丸可以治疗寒性消炎痛型胃溃疡，预防寒性水浸应激型胃溃疡的形成，均可通过升高大鼠胃组织中EGF和TGF－α的含量而实现，证明本实验所采用的“病证结合”的胃溃疡造模方法确切可行。

［1］ 李冀，柴剑波，毕珺辉，等.大黄黄连泻心汤、理中丸对胃寒证、胃热证模型大鼠基础代谢的影响［J］.中医药学报，2010，38(5):55－57.

［2］ 李冀，谢田，柴剑波，等.大黄黄连泻心汤、理中丸对幽门结扎型、醋酸涂抹型胃溃疡寒热证模型大鼠血清NT含量的影响［J］.中医药学报，2011，39(1):38 －41.

［3］ 毕珺辉，李冀，谢田，等.大黄黄连泻心汤、理中丸对四种模型胃溃疡寒热证大鼠血清 PAF含量的影响［J］.中医药学报，2011，39(2):51－55.

［4］ 柴剑波，赵雪莹，毕珺辉，等.寒、热方剂对醋酸涂抹型胃溃疡寒、热证模型大鼠血清VEGF、胃组织bFGF含量的影响［J］.中医药信息，2011，28(3):122 －124.

［5］ Brzozowski T，Konturek S T，Majka J，et al.Epidermalgrowth factor polyamines，and prostaglandins in healing of stress－indu－cel gastric lesions in rats.Dig Dis Sci，1993，38:276.

［6］ Tamawski A，Santos A M，Hanke S，et al.Quality of gastric ulcer healing is it influenced by antiulcer drugs.Scand J Gastroenterol Suppl，1995，208:9 －13.

［7］ 刘红.转化生长因子α对消化性溃疡的修复作用研究进展［J］.国际消化病杂志，2006，26(5):320 －321.