大白菜干烧心病基因AFLP分子标记的研究

黄 萍，王五宏，李必元，岳智臣，钟新民

(浙江省农业科学院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021)

大白菜 ［BrassicacampestrisL．ssp．pekinensis(Lour．)Olsson］是十字花科芸薹属芸薹种的一个亚种，又名结球白菜，原产我国，是我国栽培历史最悠久、种植范围最广泛、栽培面积最大、销售时间最长的蔬菜，尤其在秋、冬季蔬菜供应中处主导地位。实践证明，大白菜生产的好坏直接影响着我国蔬菜市场供应和人民生活。但是，近年来干烧心病成了危害大白菜生产的主要病害之一。此病是由缺钙引起的生理性病害［1－2］，国内外学者对干烧心病的表观性状、发病机理及防治方法方面进行了大量研究，但深入到分子方面的研究却鲜见报道［3－4］。本实验以高抗品系小孢 C8和高感品系651A及其杂交的F2代为材料，利用AFLP技术和BSA法相结合，通过210对引物组合对大白菜干烧心病的AFLP标记进行筛选，以期建立大白菜抗干烧心病AFLP分子标记辅助选择技术，为开展白菜抗干烧心病分子标记辅助育种提供帮助。

1 材料与方法

1.1 材料

以浙江省农科院蔬菜所十字花科蔬菜育种课题组提供的DH系小孢C8和高代自交系651A及小孢C8×651A的F2代分离群体为材料。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 (CTAB小量法)

将2 mL离心管盖大小新鲜叶片2～3片放入研钵中，加300 μL 2%的CTAB缓冲液研磨，然后再加入300 μL CTAB缓冲液混匀;65℃水浴1 h，其间上下颠倒混匀数次，1 h后取出冷却至室温;然后加入700 μL 24∶1的氯仿/异戊醇的混合液，上下颠倒摇晃使氯仿/异戊醇与样品充分混匀;12 000 r·min－1离心10 min;将上清液取出 放入到已灭菌的1.5 mL离心管中，然后加入等体积的异丙醇，轻轻上下颠倒混匀，4℃冰箱静置30 min以上;10 000～12 000 r·min－1离心 10 min，弃上清液;弃掉上清液之后将离心管倒置于吸水纸上半小时以上，使异丙醇挥发干净;必要时可以在通风橱里通风，加速挥发;挥发干净后，加入50～100 μL的dd H2O(含 1μL 10 mg· ml－1的 RNase) 溶 解DNA，室温30 min除去RNA;将提取好的DNA储存在－20℃的冰箱中备用。

1.2.2 基因组DNA浓度及纯度检测

用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，取5 μL模板，加入1 μL Loading Buffer，混匀后加入到1%的琼脂糖凝胶样孔中，在1%TAE缓冲液中电泳30 min，电压为150 V，紫外灯凝胶成像系统下观察。并以50，100，150，200 mg·L－14 个梯度的 λDNA 为对照，观察对照及样品DNA亮度，判断样品DNA质量并估计浓度，记录各样品浓度，最后将样品浓度统一调至 20 ～100 mg·L－1。

1.2.3 AFLP标记

AFLP的操作流程参照中国农科院蔬菜改良中心生物技术室的方法，DNA的酶切连和选择扩增的浓度稍有改动。

酶切连接反应体系共 25 μL:dd H2O 15.5 μL，10 × NEB buffer2 2.5 μL，ATP(10 mmol)0.5 μL，100 × BSA 0.25 μL，EcoR I adapter(5 pmol)0.25 μL，MseI adapter(50 pmol)2.5 μL，EcoR I(10 U)0.25 μL，MseI(10 U)0.25 μL，3 unit T4 DNA ligase 0.5 μL，DNA(50 ～250 ng)。混匀后37℃水浴或PCR仪中过夜约12 h。

预扩增反应体系 10 μL:dd H2O 5.95 μL，10× PCR buffer 1.0 μL，10 mmol dNTPs 0.2 μL，E1(10 pmol·μL－1)0.3 μL，M1(10 pmol·μL－1)0.3 μL，Taq-polymerase(2 units·μL－1)0.25 μL，酶切连接后模板2 μL。反应程序:94℃预变性3 min;94℃ 30 s→56℃ 30 s→72℃ 1 min，24个循环;最后72℃10 min;4℃保存。

选择性扩增反应体系 10 μL:dd H2O 6.05 μL，10 × PCR buffer 1.0 μL，10 mmol dNTPs 0.2 μL，Mse-primer(10 pmol·μL－1)0.5 μL，Eco-primer(10 pmol·μL－1)0.5 μL，Taq-polymerase(2 units·μL－1)0.25 μL，40 × 稀释后产物 1.5 μL。反应程序:94℃ 3 min;94℃ 30 s→65℃ 30 s→72℃ 1 min，每次循环的退火温度降低0.7℃，共12个循环;94℃ 30 s→56℃30 s→72℃ 1 min，共25个循环;72℃ 延伸5 min，4℃ 保存。

电泳检测:选择性扩增反应结束后，将10 μL反应体系中加入6×Loading buffer(载样缓冲液)8 μL，95℃ 变性 10 min，立即置于冰上冷却。6% 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，每个样品取4 μL上样，70 W恒功率预电泳2 h，至溴酚兰刚刚跑出电泳板下端时卸板，银染检测。

1.2.4 AFLP分析

采用相关分析法，对AFLP标记与大白菜干烧心病发病指数之间的相关关系进行分析，计算相关系数，并验证AFLP标记与白菜干烧心病基因之间的连锁关系。

2 结果与分析

把预扩增的产物稀释40倍作为选择性扩增的模板，选用EcoR I引物15条与MseI引物14条相互组合，共210对AFLP引物组合分别对抗病亲本池R、感病亲本池S、F2抗病池 BR、F2感病池BS进行扩增。扩增结果 (图1)显示，大部分引物在4个池间都能稳定地扩增出清晰的条带。210对引物中，引物 E-AGA/M-CAG在抗病亲本池R、感病亲本池S、F2抗病池BR、F2感病池BS中能稳定的扩增出一条差异带，该条带命名为E10/M05，图1中箭头所指即为E10/M05。

图1 部分AFLP引物对在4个模板间的扩增谱带

通过对亲本池及F2群体里的抗病池与感病池的筛选，得到1条稳定的差异带，为检验该标记是否适用于在整个F2代群体分析，从F2代群体里挑选10个高抗单株和10个高感单株用该引物进行扩增，扩增结果见图2。

由图2可见，在20个小群体中10个高抗单株中均无出现该条带，而10个高感单株中都扩增出了此条带。因此，该标记可能与某一感病基因具有一定的相关性，为进一步验证该标记，扩大F2群体到49个单株，扩增结果见图3。

通过49个小群体扩增结果可以看出，在26株抗病单株中，有5株出现该条带，在23株感病单株中均出现该条带，由此推测该标记可能与干烧心某一感病基因具有连锁性，为验证该连锁性，将该标记在整个F2代群体里进行扩增，结果显示E10/M05引物组合所检测到的多态性标记E10/M05与大白菜干烧心病感病性状是相连锁的，这个标记与大白菜干烧心病某个感病基因共分离。抗病亲本及抗病单株无条带，感病亲本及感病单株有条带。在136个F2单株中，E10/M05标记与干烧心病情级数的相关系数为0.633(r=0.633＞r0.01=0.228)，达到极显著相关。该标记的存在与干烧心病病情指数的增加达到了极显著相关，表明该标记与控制大白菜干烧心病的某个感病基因紧密连锁。

图2 引物组E10/M05在651A、小孢C8、BR、BS及20个小群体中的扩增结果

图3 引物组E10/M05在651A、小孢C8、BR、BS及其49株单株中的扩增结果

3 小结与讨论

关于大白菜分子标记的研究一直受到高度重视。目前，抗芜菁花叶病毒 (TuMV)［5］、雄性不育［6］、耐热性［7］、软腐病［8］和大白菜叶球相关性状［9］、大白菜叶色相关性状［10］及部分形态性状［11］等重要性状的分子标记研究取得了一定进展。对于大白菜干烧心病的研究，前人主要是集中在发病原因、发病机理、防治措施、症状表现及影响因素等方面，深入到分子方面的研究却少见报道。孙秀峰等 (2006)首次将大白菜干烧心的研究深入到分子方面，构建了一张含105个标记位点，11个连锁群，覆盖长度为669.7 cm的大白菜的AFLP分子遗传图谱。并检测到4个与抗干烧心病有关的QTL位点，其解释的遗传变异范围在11.0%～58.9%之间。将大白菜干烧心病的研究深入到了分子层面，为利用分子标记辅助选育大白菜抗干烧心病品种进行了开创性工作［3］。本实验以高抗品系小孢C8和高感品系651A及其杂交的F2代为材料。利用AFLP技术和BSA法相结合，通过210对引物组合对大白菜干烧心病的AFLP标记进行筛选，最终找到了1个AFLP标记能在2个亲本以及抗、感病池中扩增处差异条带。然后从F2代中挑选出高抗和高感单株各10株进行验证，发现感病单株均有该条带，抗病单株均无该条带，进一步扩大群体到49个，初步估计该标记与目的基因具有连锁关系。最后，在整个F2群体中进行验证，结果显示该标记E10/M05与大白菜干烧心病表观性状是相连锁的，这个标记与干烧心病某个感病基因共分离。

然而本实验的不足之处在于用于筛选标记的个体相对不多，所选引物的多态性比率相对较低，下一步实验应扩大引物对及F2群体，确定标记与抗病基因的遗传距离，用于白菜抗干烧心病育种工作。

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