渗透压对马铃薯种质试管保存的影响效应

齐恩芳，王一航，李高峰，贾小霞，文国宏

（甘肃省农科院马铃薯研究所，兰州，730070）

马铃薯是无性繁殖作物，其实生种子性状高度分离不宜作为种质保存，而以块茎方式 “春种，秋收，冬窖藏”经大田继代繁殖保存要花费大量的人力、物力和财力，并占用一定面积的土地，而且由于连年田间种植和冬贮，导致各种病害不断侵染和病毒积累，造成种质资源退化、混杂或遗失，同时，也不便于种质的管理、交换与发放。利用组织培养技术保存可避免田间病虫害的侵害，减少种质资源流失，又具有占用空间小，便于交流等优点。但常规组织培养保存继代时间短（30 d左右），多次继代可能造成交叉污染，消耗人力物力，且易引发遗传变异。

添加有高渗化合物的培养基常用于植物材料的长期保存。这类化合物提高了培养基的渗透势负值，造成水分逆境，降低细胞膨压，使细胞吸水困难，新陈代谢活动减弱，从而延缓细胞生长。不同的高渗化合物适于不同的植物种类，50～90 g/L高浓度蔗糖延长了百合试管苗的保存时间[1]，樱桃、柿和君迁子的试管苗在添加甘露醇的培养基中延长保存效果较好，而高浓度甘露醇取代蔗糖不利于柑橘种质离体保存[2～4]。本研究以马铃薯试管苗为试材，探讨蔗糖和甘露醇不同浓度配比对延缓试管苗生长的效应，以期为马铃薯试管苗种质保存提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为菲多利马铃薯试管苗。

1.2 试验方法

以MS为基本培养基，添加不同浓度的蔗糖与甘露醇（MNT），形成蔗糖与甘露醇不同浓度配比的组合13个 （表1）。培养基中琼脂粉0.45%，pH值5.8，分装于 100 mL三角瓶中，每瓶 40 mL，121℃，1.06 kg/cm2灭菌20 min。每瓶接种5个带腋芽的无菌试管苗茎段，每处理18瓶，在自然光照培养室培养，温度变化范围5～30℃。每3个月统计1次试管苗的成活率（植株开始萎蔫或叶片开始发黄脱落记为死亡），保存3个月时测定试管苗的株高、结薯数。文中数据采用SPSS软件统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同浓度蔗糖对试管苗保存的影响

表1 蔗糖与甘露醇不同浓度配比组合

随培养基蔗糖浓度增加，试管苗生长减缓，由于渗透压增大，水分蒸发较少，蔗糖浓度较高时，后期培养基剩余较多。生长3个月时，3种蔗糖浓度对试管苗的生长影响差异显著，蔗糖浓度越高，试管苗生长就越缓慢（图1），80 g/L蔗糖的处理效果显著。

蔗糖浓度对试管苗存活率的影响见图2，随着保存时间的持续，蔗糖浓度越高，试管苗保存时间越长。不加蔗糖和添加30 g/L蔗糖的CK，试管苗前期生长良好，植株健壮。不加蔗糖的试管苗在1个月后生长减缓，长势变弱，植株基部部分叶片逐渐失绿白化，随后由于养分缺失，3个月时全部死亡；而CK植株因过度生长逐渐衰老，基部叶片干枯，茎段中部长满气生根，只有植株顶梢部分可用，3个月时有部分死亡，在6个月时全部死亡。添加60 g/L蔗糖的处理4和80 g/L蔗糖的处理8，试管苗前期生长较好，3个月后存活率为100%，有试管薯形成，但叶片呈黄绿色；保存6个月时，处理4有22.2%死亡，处理8全部成活；至9个月时，处理4成活率为33.3%，平均结薯0.44个，处理8成活率为55.6%，平均结薯1.06个。试验结果表明，提高培养基中的蔗糖浓度具有减缓马铃薯试管苗生长，延长保存时间的作用，60～80 g/L的蔗糖可使马铃薯试管苗比对照延长存活3～6个月，可用于其短期（如越夏）保存。

2.2 不同甘露醇浓度对试管苗保存的影响

甘露醇能够提高培养基渗透压，从而抑制试管苗的生长[5]。在蔗糖浓度为30 g/L的培养基中加入不同浓度的甘露醇，马铃薯试管苗的生长受到不同程度的抑制，试管苗保存时间得到不同程度的延长（图3）。没有添加甘露醇处理的试管苗在培养3个月时株高达11.24 cm，加入甘露醇后因水分和养分吸收受阻，植株生长减慢，株高受到抑制，且甘露醇对茎高的抑制作用与甘露醇浓度呈正相关。当甘露醇浓度为10 g/L时，试管苗生长比对照慢，但经方差分析其差异不显著，当甘露醇浓度达到20 g/L以上时，其抑制生长的效果与其他处理差异达到显著水平。

不同甘露醇浓度处理除对试管苗生长存在抑制作用外，对试管苗的存活率也有较大影响（图4）。没有添加甘露醇处理的试管苗保存到3个月时开始出现死亡现象，培养基中添加甘露醇的处理试管苗存活率则高达100%，当保存时间延长至6个月时，没有添加甘露醇的处理试管苗全部死亡，而培养基中添加甘露醇的处理1～3的存活率则分别为77.8%，94.4%，72.2%，说明甘露醇对于提高试管苗的存活率十分有效。

图1 不同浓度蔗糖对马铃薯试管苗株高和结薯数的影响

图2 不同浓度蔗糖和保存时间对马铃薯试管苗存活率的影响

图3 不同浓度甘露醇对马铃薯试管苗株高的影响

图4 不同浓度甘露醇和保存时间对马铃薯试管苗存活率的影响

2.3 不同浓度蔗糖与甘露醇配比对试管苗保存的影响

由图5可看出，低浓度（30 g/L）蔗糖添加不同浓度甘露醇后对试管苗的抑制作用均较弱，虽然6个月后存活率均在70%以上，但植株衰老，仅顶梢部分呈嫩绿色，且9个月后均无成活；中等浓度（60 g/L）蔗糖添加10，20 g/L甘露醇的试管苗保存9个月后仍有50%以上的存活率，但添加30 g/L甘露醇的处理7试管苗保存9个月时存活率仅为16.7%；高浓度（80 g/L）蔗糖对试管苗的抑制作用较为明显，其中与30 g/L甘露醇组合的渗透胁迫最为强烈，试管苗接种20 d后基部叶片黄化，随着培养时间的延长，萌发的腋芽也逐渐黄化死亡，9个月后全部死亡，而处理9，10试管苗保存9个月后分别保持了66.7%和83.3%的存活率。试验结果表明，较低浓度的甘露醇（10 g/L和20 g/L）结合中高浓度的蔗糖有利于试管苗的保存，以20 g/L甘露醇+80 g/L蔗糖处理保存效果明显。

处理5，6，9，10间试管苗株高差异显著，其中处理5，6的试管苗显著高于处理9，10的，说明蔗糖和甘露醇综合浓度较高，即渗透压较高时，马铃薯试管苗株高相对较低。高浓度蔗糖可诱导试管苗结薯，试管薯在保存3个月后形成，处理9，10的平均结薯数显著高于处理5，6，达到1个/株左右，在保存后期植株死亡后，试管薯转接至快繁培养基上可形成正常植株继续生长。

图5 不同配比蔗糖和甘露醇对马铃薯试管苗存活率的影响

图6 不同配比蔗糖和甘露醇对马铃薯试管苗株高和结薯数的影响

3 小结与讨论

通过提高培养基的渗透压可延缓植物生长。常用渗透压调节物质有甘露醇、蔗糖等[6～8]。相对于蔗糖，甘露醇不易被植物吸收，在种质保存应用中，甘露醇的作用是提高培养基渗透压，从而抑制保存材料的生长。甘露醇对外植体生长的抑制作用持久，其作用机理是消除了细胞扩大生长所必需的膨压，同时细胞壁酶活性也受到抑制，使细胞生长受阻，减少了养分消耗[9]。Withers等[10]和Ng等[11]使用浓度为4%甘露醇来保存种质，在8℃培养温度下，可使继代周期超过1 a。甘露醇虽然能够延缓试管苗的生长，但是，浓度高于5%时，会造成植物生活力下降[12，13]。本试验中，试管苗在无甘露醇的培养基中保存6个月时全部死亡，添加10～30 g/L的甘露醇后，存活率大大提高，均达到70%以上，能保存到9个月以上。

离体培养条件下,糖类物质是试管苗生存和生长的主要碳源，同时可维持培养基的渗透压。本试验的结果也充分证明了这一点，不加蔗糖的处理，因碳源不足试管苗生长缓慢，生长势弱。若植株靠自身微弱的光合作用合成少量的碳水化合物来维持其生长发育，一般保存时间不超过3个月。随着附加蔗糖浓度由30 g/L增加到80 g/L，蔗糖表现出明显的由作为碳源向作为渗透物质的过渡。当蔗糖浓度为30 g/L时，碳源充足，植株长势良好，即使附加10～30 g/L的甘露醇也不能有效地减缓其生长速度，保存到6个月时试管苗已严重衰老，死亡严重，9个月后全部枯死；而当蔗糖浓度增加到80 g/L，并配合20 g/L甘露醇时，试管苗生长极其缓慢，保存9个月后仍有83.3%的存活率。

本研究结果表明，马铃薯试管苗的离体保存完全可以达到短期保存的目的。在培养基中添加适宜浓度的蔗糖和甘露醇，利用蔗糖在培养基中的双重作用及甘露醇的渗透调节作用，在添加80 g/L蔗糖和20 g/L甘露醇的培养基中取得了良好的保存效果，能最大程度地延缓马铃薯试管苗的生长，继代周期在9个月以上。但为了种质安全，保存材料应适当增加备份，每2～3个月检查1次，当存活苗显著减少时，应及时恢复培养，使试管苗恢复生长活力，然后再进行下一周期的保存。另外种质离体保存除利用调节蔗糖浓度与添加甘露醇等措施外，还常与低温处理等结合，因此，应深入开展将低温处理、调节蔗糖浓度及添加甘露醇等结合对马铃薯离体保存影响的研究，以期进一步延长保存的时间、提高成活率。

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