金花茶醇提物对人低分化鼻咽癌CNE-2细胞增殖和周期的影响

朱 华，邹登峰，沈 洁，张可峰，张小玲，朱 林

(1广西中医学院，南宁 530022;2桂林医学院)

金花茶是一种具有极高药用价值的天然中草药，民间称其“神茶”。2009年5月～2010年11月，我们观察了金花茶醇提物对人低分化鼻咽癌CNE-2细胞增殖和周期的影响，旨在为进一步研究金花茶抑制肿瘤细胞生长的机制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料 人低分化鼻咽癌细胞株CNE-2细胞(桂林医学院科学实验中心所提供);金花茶醇提物(桂林医学院药学院提取，用含10%小牛血清的DMEM培养基逐级对倍稀释成各种实验所需浓度);DMEM培养基(Gibco公司，美国);小牛血清(杭州四季青生物制品厂);胰蛋白酶(Sigma公司);甲基偶氮唑盐(Amresco公司，美国);Hoechst33342荧光染料(凯基生物工程材料有限公司);其余试剂为进口或国产分析纯。SW-CJ-2FD超净工作台，CO2细胞培养箱(Thermo Fisher公司，美国)，倒置相差显微镜、荧光显微镜(Olympus公司，日本);平板离心机，96孔培养板(Deta公司，美国)，FACScan型流式细胞仪(Becton Dickinson公司，美国)，普通及超低温冰箱、电热恒温干燥箱、微量移液器等。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 将人低分化鼻咽癌细胞株CNE-2细胞接种于含10%灭活小牛血清，含青霉素、链霉素各100 U/ml的DMEM培养液中，细胞培养用50 ml培养瓶，置于37℃、5%CO2饱和湿度下的培养箱培养，3 d传代1次，取对数生长期的细胞进行实验。

1.2.2 金花茶醇提物干预及细胞增殖抑制率检测采用MTT法。取对数生长期的CNE-2细胞接种于96孔培养板，调整细胞密度为4×103/ml，每组设3个平行孔，24 h待细胞贴壁后，实验组加入终浓度为 25、50、100、200、400 μg/ml的金花茶醇提物孵育，每孔200 μl，实验中同时设阴性对照组(不加药物的细胞悬液)和空白调零组(含10%小牛血清的DMEM培养基)。药物作用24、48、72 h后加入20 μl(5 mg/ml)的MTT，继续培养4 h，弃上清液，每孔加入150 μl DMSO，震荡均匀 5 min，在酶标仪上测490 nm的吸光度(OD)值，计算细胞增殖抑制率及IC50。细胞增殖抑制率=(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值×100%。

1.2.3 金花茶醇提物干预及细胞形态观察 六孔板内每孔接种4×104个CNE-2细胞，24 h细胞贴壁后，分成实验组和对照组，每组均设3个复孔，作用48 h后用倒置相差显微镜观察并照相记录实验组和对照组细胞的形态变化。同时，采用多聚甲醛室温固定，Hoechst 33342染色，荧光显微镜观察照相。

1.2.4 金花茶醇提物干预及细胞周期及凋亡率检测 取对数生长期细胞，每孔4×104个CNE-2细胞接种于六孔板中。培养24 h后细胞贴壁，实验组加入 50、100、200 μg/ml的金花茶醇提物，对照组不加药物。收集培养细胞，75%乙醇(4℃预冷)固定细胞过夜后送检。样本上机前将乙醇固定的细胞离心洗涤，加RNA酶(终浓度为0.5 g/L)，37℃水浴30 min，加碘化丙啶终浓度为1 g/L，振荡混匀，30 min后上机检测，进行细胞周期及凋亡率分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件。计量数据以表示，各组间均数差异比较采用独立样本t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 细胞增殖抑制率 见表1。由表1可见，随金花茶醇浓度增加，增殖抑制率逐渐升高，呈剂量依赖性。

2.2 细胞形态 ①倒置相差显微镜下观察:镜下见阴性对照组细胞呈延展、扁平贴壁生长，细胞清晰，细胞均质而透明，核膜、核仁轮廓明显，细胞间结构紧密，生长旺盛。而经过48 h药物处理后，50 μg/ml组的细胞形态变化不明显，增殖受到抑制，生长缓慢，几乎停滞。100 μg/ml组可见部分细胞皱缩变小、变圆，细胞间接触变松，逐渐由贴壁而脱落。200 μg/ml组可见大量细胞形态变圆、收缩、破碎，折光性差，脱落细胞悬浮于培养液中。根据图示随着浓度的升高，生长抑制越明显。②荧光显微镜下观察:阴性对照组CNE-2细胞核呈现弥散均匀的淡蓝色荧光，核饱满、大小均匀。50 μg/ml金花茶醇作用48 h后出现细胞凋亡，凋亡的细胞体变小，与周围细胞分离，呈现致密浓染的强蓝色荧光。药物浓度升至100 μg/ml时，细胞骨架解体，核固缩，边聚致密浓染的强蓝色荧光。200 μg/ml作用后，出现了核裂解，核染色质聚集，呈现明显细胞凋亡形态。随着药物浓度的升高，凋亡细胞也逐渐增多。

表1 实验组不同时点细胞增殖抑制率(%)

2.3 细胞周期及凋亡率 见表2。由表2可见随着药物浓度的增加，G1期细胞比例增高，S期、G2期细胞比例降低，与对照组比较有显著性差异，且呈剂量依赖性。随着金花茶醇提物浓度的升高，细胞凋亡率亦逐渐增高。

表2 两组细胞周期及凋亡率比较(%，)

表2 两组细胞周期及凋亡率比较(%，)

注:与对照组比较，*P ＜0.05，△P ＜0.01

组别 G1期 S期 G2期 凋亡率实验组50 μg/ml 57.76 ±0.242△ 31.10 ±1.047*10.57 ±0.321*11.39 ±3.166100 μg/ml 60.27 ±0.608*29.70 ±0.736* 9.62 ±0.350*23.96 ±1.046200 μg/ml 64.20 ±0.901*27.31 ±0.662* 8.48 ±0.378*35.40 ±1.035对照组 55.44 ±1.258 34.93 ±0.288 11.59 ±0.205 1.15 ±0.500

3 讨论

金花茶属无毒级，金花茶叶含有多种氨基酸、茶多酚、皂甙类、黄酮类等人体所需的有益成分，且富含对人体有重要的保健作用的微量元素。其可改善因高血压引起的各种不适症状及抗菌消炎、清热解毒、利尿消肿、增强肝肾脏活力、防止血动脉硬化，防癌抑制肿瘤生长等［1～3］。金花茶叶子在民间被用于清热解毒、利尿利湿、止痢和止血等，《本草纲目》对它的药用价值有一定记载。研究证实，金花茶对肝癌细胞株BEL-7404、人宫颈癌HeLa S3细胞、人前列腺癌PC3细胞及人单核细胞白血病细胞株U937细胞均有不同程度的抑制生长的作用［4～6］。

细胞周期监控机制的失控可发生在细胞增殖、损伤感应、DNA修复、细胞死亡等任何一个环节，从而引起细胞的基因组不稳定［7］。本研究发现，金花茶醇提物具有抑制肿瘤细胞增殖的作用，且呈时间和剂量依赖性。倒置显微镜下观察显示随着药物浓度的增高，细胞变小皱缩，细胞间隙疏松，部分细胞悬浮。细胞周期是细胞分裂的完整体现，细胞周期的运转是一个有序的基因调控过程(G1→S→G2→M)，这是细胞周期相关的基因在时间和空间上进行有序表达的结果，不能完成一个周期的细胞将进入程序化死亡或发生癌变。G1期监测点功能的失活是肿瘤细胞的重要标志。本研究证实，金花茶醇提物可将细胞阻滞于G1期，影响细胞周期继续转变的过程，进而减少进入G2和S期的细胞数目，减少其有丝分裂;阻滞效果与药物作用浓度呈正相关。

金花茶醇提物能够抑制CNE-2细胞的增殖，其作用机制可能与诱导其G1期阻滞有关。

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