乳腺癌组织中 FOXO3a、β-Catenin、PCNA 的表达及临床意义

徐骏飞，江 颖，倪启超，何志贤，汪 涛，徐 青，3*

(1南通大学附属医院，南通大学医学院，江苏 南通 226001;2复旦大学附属中山医院;3中国康复研究中心)

近年来，乳腺癌在我国的发病率和病死率迅速上升，已成为威胁女性健康的常见恶性肿瘤之一。2009年12月～2010年9月，我们采用免疫组化En vision两步法检测了乳腺癌组织中叉头转录因子(FOXO3a)、β-连环素(β-Catenin)、增殖细胞核抗原(PCNA)的表达，旨在进一步探讨乳腺癌的发生、发展机制。

1 材料与方法

1.1 材料 选择我院手术切除的乳腺癌组织标本68份(肿瘤组)，患者均为女性，年龄29～86岁，中位年龄48岁;年龄≤50岁45例，＞50岁23例。所有患者均经病理证实，且术前均未行化疗。按照2006年WHO乳腺肿瘤组织学分类Ⅰ级22例，Ⅱ级35例，Ⅲ级11例;肿瘤直径≤2.0 cm 22例，＞2.0 cm 46例;腋窝淋巴结转移阳性28例;雌激素受体(ER)阳性34例;PR阳性24例;HER2-～+33例，++～+++35例;采用国际抗癌协会(UICC)TNM分期法Ⅰ级15例，Ⅱ级35例，Ⅲ级18例;术后死亡12例(中位生存时间4年4月)。另选同期保存的20份乳腺纤维腺瘤组织标本(腺瘤组)作对照，两组一般资料无统计学差异。主要试剂:兔抗人FOXO3a(75D8)、兔抗人 β-Catenin(Cell Signal公司)，鼠抗人PCNA(PC10):sc-56(Santa Cruz公司)，HRP标记的山羊抗小鼠IgG、HRP标记的山羊抗兔IgG(Sigma 公司)，柠檬酸抗原修复液(pH 6.0，0.01 mol/L)及DAB显色剂(北京中杉生物技术有限公司)。

1.2 FOXO3a、β-Catenin、PCNA 表达检测 采用Envision两步法。所有标本均经石蜡包埋，组织5 μm连续切片，常规脱蜡至水，0.3%H2O2-甲醇溶液37℃ 30 min，柠檬酸缓冲液高压抗原修复3 min，5%二抗正常血清室温封闭2 h，一抗室温孵育1 h后4℃过夜。FOXO3a、β-Catenin和 PCNA抗体的工作稀释度均为1∶100，DAB显色，苏木精对比染色。采用已知的免疫组化染色阳性标本作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。结果判断:光镜下每张切片选取5个有代表性的高倍视野(×400)，每个视野随机计数300个肿瘤细胞，共计1500个，计算阳性细胞百分率，按阳性细胞所占比例分级。FOXO3a和PCNA蛋白表达主要定位于细胞核，以出现棕黄色颗粒为阳性细胞，阳性细胞百分数＜10%为阴性，≥10%为阳性。β-Catenin表达主要定位于细胞膜，细胞膜呈棕褐色细小颗粒状着色为阳性。根据文献将染色计为0～3分。0分:细胞膜、质均未染色“-”;1分:细胞质染色为主“+”;2分:异质性染色(细胞膜、细胞质、细胞核混合染色)“++”;3分:连续的细胞膜染色“+++”。0、1和2分者均为异常表达。

1.3 统计学方法 采用SPSS15.0、Stata7.0统计软件。各组数据间比较采用χ2检验，各指标间相互关系比较用Spearman等级相关分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 FOXO3a、β-Catenin、PCNA 表达 肿瘤组、腺瘤组 FOXO3a阳性表达率分别为60%、90%，β-Catenin异常表达率分别为65%、25%，PCNA阳性表达率分别为69%、35%，P均＜0.05。

2.2 FOXO3a、β-Catenin、PCNA 表达与乳腺癌临床病理参数的关系 见表1。

表1 FOXO3a、β-Catenin、PCNA蛋白表达与乳腺癌临床病理参数的关系

2.3 相关性分析 乳腺癌组织中FOXO3a阳性表达与β-Catenin异常表达、PCNA阳性表达均呈负相关(r分别为 -0.145、-0.173，P 均 ＜ 0.05)，β-Catenin异常表达与PCNA阳性表达呈正相关(r=0.04，P ＜0.05)。

3 讨论

乳腺癌是发达国家中致死率较高的肿瘤性疾病，其发生发展是多基因多因素共同作用的结果。转录因子FOXO3a是发育调节转录因子叉头基因家族中的一员，是PI3K-Akt信号通路中起关键作用的重要因素之一，其含有一个高度保守的DNA结构域，由100个含有特征性α螺旋、β链及环1和C末端［1～3］保守的氨基酸残基组成。其定位于6号染色体，并编码673个氨基酸。研究发现，FOXO3a在细胞的增生、转化、分化、衰老等过程中发挥重要的调控作用;在多种癌组织中表达［4］。Jin等［5］发现，FOXO3a蛋白在乳腺肿瘤不同组织学类型中表达，良性肿瘤中绝大多数FOXO3a广泛存在于细胞质中，且处于非活性状态。而在恶性乳腺中，大多数表达以活化形式存在于细胞核中。本研究肿瘤组FOXO3a阳性表达率明显低于腺瘤组，提示FOXO3a的表达失活可能与乳腺癌的发生相关。FOXO3a阳性表达与乳腺癌腋窝淋巴结转移、ER、临床分期、预后相关，提示随着乳腺癌的进展，FOXO3a表达率降低。FOXO3a可能不仅与乳腺癌的发生相关，且与乳腺癌的进展密切相关。

目前研究证明，癌基因的致癌作用及抑癌基因的抑癌作用是多个基因共同作用的结果。β-Catenin是一胞质蛋白，除参与细胞间黏附过程中钙黏着蛋白与细胞骨架的肌动蛋白黏附，在Wnt通路中发挥比较关键的作用。致癌的关键是β-Catenin降解障碍致使胞质内游离的β-Catenin聚集并与Tcf/Lef结合进入细胞核，激活下游靶基因CyclinD1、C-myc的转录，导致肿瘤的发生。正常乳腺组织中β-Catenin主要表达于细胞膜，在细胞质和细胞核中几乎不着色，而乳腺癌组织中则相反，主要在细胞质或细胞核内聚集表达［6，7］。本研究肿瘤组 β-Catenin 异常表达率明显高于腺瘤组，提示β-Catenin的高表达在乳腺癌的发生中可能起重要作用。β-Catenin异常表达与乳腺癌组织学分级、腋窝淋巴结转移、临床分期相关，提示其高表达可能在乳腺癌的恶性程度和转移性有密切关系。

PCNA 是瘤细胞增生活跃的指标［8，9］，是判断乳腺癌预后的有效标记物。PCNA的表达与瘤细胞的生物学行为密切相关，阳性表达者特别是阳性强度越高时预后较差。本研究肿瘤组PCNA阳性表达率明显高于腺瘤组，提示PCNA在恶性组织中的表达明显高于良性组织。PCNA阳性表达与乳腺癌腋窝淋巴结转移、临床分期相关，提示PCNA高表达增加了瘤细胞转移的危险性。本研究还发现，乳腺癌组织中FOXO3a阳性表达与β-Catenin异常表达、PCNA阳性表达均呈负相关，β-Catenin异常表达与PCNA阳性表达呈正相关。说明 β-Catenin、PCNA可能作为FOXO3a作用途径中的相关基因，相互作用共同参与乳腺癌的发生过程。但FOXO3a与β-Catenin、PCNA基因的相互作用机制尚待进一步研究。

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