青霉素影响甜菜夜蛾幼虫耐受几种苏云金杆菌晶体蛋白的能力

陈瑞瑞， 崔金杰， 李国清＊

（1.南京农业大学植物保护学院／教育部病虫害综合治理重点开放实验室，南京 210095；2.中国农业科学院棉花研究所／棉花生物学国家重点实验室，安阳 455000）

青霉素影响甜菜夜蛾幼虫耐受几种苏云金杆菌晶体蛋白的能力

陈瑞瑞1， 崔金杰2， 李国清1＊

（1.南京农业大学植物保护学院／教育部病虫害综合治理重点开放实验室，南京 210095；2.中国农业科学院棉花研究所／棉花生物学国家重点实验室，安阳 455000）

本文评估了Cry1Ab、Cry1Ba和Cry1Ca蛋白对甜菜夜蛾2龄幼虫的毒力，其LC50分别为0.442 5、0.675 7μg／cm2和0.150 2μg／cm2，Cry1Ba毒力最低，其次是Cry1Ab，而Cry1Ca毒力最高。青霉素影响幼虫对晶体毒素的耐受能力；一次添加高剂量（500μg／cm2）青霉素于饲料中显著提高幼虫的耐受能力，以含低剂量（60μg／cm2）青霉素的饲料饲养幼虫多代也能达到相似的效果。

苏云金杆菌； 晶体毒素； 甜菜夜蛾； 青霉素； 毒力

＊ 通信作者 E-mail：liguoqing001234＠yahoo.com.cn

转苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis）晶体毒素（Cry toxin）基因的棉花品种在我国已大面积种植多年。其应用提高了棉花的抗病虫能力、产量、质量以及棉农的收入，减轻了环境污染，防止了农药中毒。但近几年转基因棉花却受到甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）越来越严重的为害［1］。原因之一是转入棉花品种的Cry毒素基因大都由cry1Ac基因改造而来，其产物对甜菜夜蛾幼虫毒力差［2－3］。国外的研究结果表明，Cry1Ab、Cry1Ba和Cry1Ca对甜菜夜蛾的毒力均显著高于Cry1Ac，是理想的替代毒素。但由于甜菜夜蛾幼虫对Cry毒素的耐受能力常受地理种群的影响［2－3］，因此这3种晶体毒素对我国甜菜夜蛾幼虫的毒力需重新评估。

此外，晶体毒素对鳞翅目害虫的毒力还受幼虫肠道微生物种类的影响。若杀灭舞毒蛾（Lymantria dispar）、小 红 蛱 蝶 （Vanessa cardui）、烟 草 天 蛾（Manduca sexta）、菜粉蝶（Pieris rapae）和烟芽夜蛾（Heliothis virescens）幼虫的中肠细菌，则其对Bt制剂或晶体毒素的耐受能力显著提高［4－5］。但同样措施却降低了棉红铃虫（Pectinophora gossypiel-la）［4］和小菜蛾（Plutella xylostella）［6］的耐受能力。可见，中肠微生物是否影响幼虫耐受晶体毒素的能力，不仅随虫种而不同，而且还随试验方法和地理种群而变化。

鉴于此，本文测定了我国甜菜夜蛾幼虫对Cry1Ab、Cry1Ba和Cry1Ca的耐受能力以及青霉素处理对耐受能力的影响，结果如下。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

甜菜夜蛾幼虫于2009年秋采自江苏省南京市东郊小白菜田。于养虫室内常规饲养至今。饲养条件：温度（26±1）℃、相对湿度70%～80%、光周期L∥D＝14h∥10h（光照时间为07：00～21：00）。人工饲料配方参考黄春露等［7］。老熟幼虫在剩余饲料中化蛹后，统一剥蛹，在光学解剖镜下根据生殖孔区分性别并分别保存于培养皿中。成虫羽化后，约20对雌雄蛾放置于养虫笼内，并用医用纱布覆盖笼口，任其交配并产卵。饲以5%蔗糖水且每天定时更换。每天收集产于纱布上的卵，用于继续饲养或试验。

1.2 试验方法

1.2.1 晶体毒素和青霉素溶液的配制和稀释

苏云金杆菌晶体毒素共3种，即Cry1Ab、Cry1Ba和Cry1Ca，均为活化毒素，购于美国一龙公司（Envirologix Inc.）。取1mg晶体毒素标准品溶解于5mL pH为10的磷酸盐缓冲液（PBS）中，终浓度为0.2mg／mL。再进一步用pH为7.4的PBS稀释，形成一系列浓度相差2倍的溶液。

纯品青霉素购置于Sigma公司。先用丙酮配制成浓度为5mg／mL的母液，再于试验前进一步用pH为7.4的PBS稀释，形成一系列浓度相差2倍的溶液，随配随用。

1.2.2 生物测定

在24孔细胞培养板中每孔加1mL刚配好的甜菜夜蛾饲料，振平冷凝。随后每孔加入溶液200μL，其中晶体蛋白溶液和青霉素溶液各100μL。若只需加入一种待测物质，则以pH为7.4的PBS液补充。对照加入pH为7.4的PBS液200μL。待加入溶液被饲料吸收，形成均匀药膜后用于试验。

将2龄初大小一致的试虫接入24孔细胞培养板中，每孔1头，重复3次。放置于养虫室内饲喂6d后检查结果。死亡试虫判断标准为：1）试虫用昆虫针刺激后无自主反应；2）刺激后虽有正常自主反应，但体重＜7mg。

1.2.3 加入青霉素累代饲养幼虫

在人工饲料中加入一定量青霉素溶液，使最终浓度为60μg／cm2。将未孵化卵块接入，累代饲养试虫。

1.3 数据分析

采用几率值分析法得到浓度对数与死亡率几率值的回归线。计算LC50和95%置信限。不同处理间LC50差异的显著性根据其95%置信限是否重叠判断。

2 结果与分析

2.1 摄食青霉素影响甜菜夜蛾幼虫对晶体毒素的耐受性

甜菜夜蛾幼虫对3种晶体毒素的耐受能力不同，对Cry1Ba最不敏感，LC50最高；其次是Cry1Ab，LC50次高；而对Cry1Ca最敏感，LC50最低。对3种晶体毒素LC50的95%置信限不重叠，表明幼虫对这3种晶体毒素的耐受能力存在显著差异（表1）。

单独饲喂只含青霉素的饲料时，浓度从30μg／cm2到500μg／cm2均不引起幼虫的死亡。而饲料中同时加入晶体毒素和青霉素后，相对毒力指数一般大于1，表明青霉素的摄入增加了甜菜夜蛾幼虫耐受晶体毒素的能力。耐受能力的提高幅度则与加入青霉素的量相关。在测定的剂量范围内，加入量越多，提高幅度越大（表1）。

图1 累代喂食青霉素对甜菜夜蛾幼虫耐受Cry1Ca能力的影响

表1 Bt晶体蛋白单独或与青霉素共同混合于人工饲料中对甜菜夜蛾2龄幼虫的毒力

2.2 含青霉素饲料累代饲养对甜菜夜蛾幼虫耐受能力的影响

以含有青霉素的饲料饲养试虫1代后，其后代幼虫对Cry1Ca的耐受能力略有提高，但根据置信区间不重叠的标准判断，与对照试虫差异显著。以含有青霉素的饲料继续累代饲养3代，对Cry1Ca的耐受能力虽进一步增高，但增长幅度变小（图1）。

3 讨论

国外研究发现，晶体毒素的毒力受幼虫肠道微生物种类的影响。但这种影响不仅随虫种不同，而且随试验方法和地理种群变化，至今没有一致结论。同时前人的研究方法还存在以下不足：1）清除肠道微生物常采用加入抗生素的方法，且加入量太大，常达到500 μg／g饲料。这影响了幼虫正常生理生化过程，间接改变了幼虫对毒物的耐受能力［6，8］。2）加入的抗生素由青霉素、庆大霉素、利福霉素和链霉素混合而成，不能判断到底是那些菌影响了幼虫的耐受能力。

为了弥补前人研究方法的不足，本文测定了青霉素影响幼虫耐受能力的剂量效应。虽然在试验过程中，青霉素不可避免地发生了部分降解，但试验结果还是表明，500μg／cm2和250μg／cm2青霉素显著提高幼虫对3种晶体毒素的耐受能力；当浓度进一步降低时，青霉素对幼虫耐受晶体毒素的能力影响不大。

可见，抗生素与晶体毒素同时使用，在抗生素剂量过高时影响幼虫正常生理生化，而在剂量过低时又无明显诱导效果。为了克服这一矛盾，本文进一步测定了添加低剂量青霉素于饲料中累代饲养幼虫对其耐受能力的影响。结果表明，幼虫用含60μg／cm2青霉素的饲料饲养1代，能略微提高其对Cry1Ca的耐受能力；连续饲养多代并不进一步提高其耐受能力。可见，这一方法虽可克服抗生素与晶体毒素同时使用方法的弊端，但能否应用于后续研究尚需进一步的试验证实。同时，本文未能证实幼虫肠道微生物是否确实受抗生素的影响，这也待后续试验证明。

［1］ 郑霞林，王攀，王小平，等.转基因棉甜菜夜蛾的为害现状、暴发成因及防治现状［J］.植物保护，2010，36（3）：34-38.

［2］ Hernández-Martínez P，FerréJ，Escriche B.Susceptibility ofSpodoptera exiguato 9toxins fromBacillus thuringiensis［J］.Journal of Invertebrate Pathology，2008，97：245-250.

［3］ Frankenhuyzen K.Insecticidal activity ofBacillus thuringiensiscrystal proteins［J］.Journal of Invertebrate Pathology，2009，101：1-16.

［4］ Broderick N A，Robinson C，McMahon M，et al.Contributions of gut bacteria toBacillus thuringiensis-induced mortality vary across a range of Lepidoptera［J］.BMC Biology，2009，7：11.

［5］ Broderick N A，Raffa K F，Handelsman J.Midgut bacteria required forBacillus thuringiensisinsecticidal activity［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，2006，103：15196-15199.

［6］ Raymond B，Johnston P R，Wright D J，et al.A mid-gut microbiota is not required for the pathogenicity ofBacillus thuringiensisto diamondback moth larvae［J］.Environmental Microbiology，2009，11：2556-2563.

［7］ 黄春霞，朱丽梅，倪珏萍，等.甜菜夜蛾的饲养方法介绍［J］.昆虫知识，2002，39（3）：229-231.

［8］ Johnston P R，Crickmore N.Gut bacteria are not required for the insecticidal activity ofBacillus thuringiensistoward the tobacco hornworm，Manduca sexta［J］.Applied and Environmental Microbiology，2009，75：5094-5099.

Penicillin ingestion influences toxic effects of several Cry toxins fromBacillus thuringiensisonSpodoptera exigualarvae

Chen Ruirui1， Cui Jinjie2， Li Guoqing1

（1.Key Laboratory of Integrated Management of Crop Diseases and Pests of Ministry of Education，College of Plant Protection，Nanjing Agricultural University，Nanjing210095，China； 2.Research Institute of Cotton，Chinese Academy of Agricultural Sciences／State Key Laboratory of Cotton Biology，Anyang455000，China）

Toxicities of Cry1Ab，Cry1Ba and Cry1Ca fromBacillus thuringiensisto the 2nd-instar larvae ofSpodoptera exiguawere evaluated.The LC50values were 0.442 5μg／cm2，0.675 7μg／cm2and 0.150 2μg／cm2，respectively.Cry1Ba was least toxic，followed by Cry1Ab，and Cry1Ca was most toxic.Penicillin affected larval tolerance to the 3Cry toxins.At the concentration of 500μg／cm2，penicillin mixed directly with the toxins could significantly increase larval tolerance.At the concentration of 60μg／cm2，however，penicillin should be first added alone to the diet for the larvae for several generations to obtain similar tolerance.

Bacillus thuringiensis； Cry toxin；Spodoptera exigua； penicillin； toxicity

S 476.11

A

10.3969／j.issn.0529-1542.2011.06.021

2011-09-14

2011-10-11

转基因生物新品种培育科技重大专项（2008X08011-002，2011ZX08011-002）