亚麻品种黑亚14号再生体系的优化

程莉莉，黄文功

（黑龙江省农业科学院经济作物研究所，哈尔滨150086）

亚麻是我国重要的纤维和油料经济作物。常规育种技术在提高亚麻的主要性状指标方面取得了一定的进展[1]。将转基因技术与常规育种手段相结合，有助于解决一些常规育种方法难以解决的特殊问题[2]。目前，亚麻遗传转化技术在基础研究及定向培育优良品种的应用方面已经受到了广泛的关注。建立良好的亚麻再生体系是亚麻遗传转化系统中十分重要的研究。本文以黑亚14为试验材料，研究了不同消毒时间对种子消毒及萌发的影响以及不同激素配比对愈伤组织诱导分化及不定芽伸长的影响。筛选出了最适的种子消毒时间、愈伤组织诱导分化培养基以及不定芽伸长培养基。旨在优化亚麻组织培养的再生体系，为亚麻遗传转化提供良好的组织培养研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

供试亚麻品种为黑亚14，由黑龙江省农科院经济作物研究所提供。

1.1.2 培养基配制

萌发培养基：MS培养基+3%蔗糖+0.8%琼脂，pH5.8；

愈伤组织诱导分化培养基和不定芽伸长培养基：MS培养基+(0.05、0.1)mg·L-1NAA+(1、2)mg·L-16-BA+(0、0.5、1.0)mg·L-1KT+3%蔗糖+0.8%琼脂，pH5.8。

1.2 方法

1.2.1 种子消毒和萌发

挑选成熟、饱满的黑亚14种子，配制70%乙醇及10%次氯酸钠溶液，设置不同的消毒时间进行种子表面消毒，每处理使用120粒种子，分3次重复，每重复40粒。先将亚麻种子直接放入70%乙醇中浸泡0.5min或1.0min，然后将种子放入10%次氯酸钠溶液中消毒15min、20min或25min，消毒期间应上下混匀3-4次，消毒后将种子用无菌水冲洗3次，将消毒后的种子接种于萌发培养基中，进行5天的暗培养及2天的16h光照/8h暗培养。观察无菌苗的生长情况，统计不同消毒处理下种子的发芽率及污染情况。

1.2.2 愈伤组织的诱导及分化

以MS为基本培养基，采用不同NAA、6-BA和KT浓度组合配制愈伤组织诱导分化培养基，在无菌条件下，切取萌发7天的亚麻无菌苗的下胚轴做为外植体材料，接入到愈伤组织诱导分化培养基中，每种激素组合接种8瓶，每瓶培养基中接种5个外植体，接种的总个数均为40个。两周继代1次，14天后观察愈伤组织诱导及分化情况，30天后观察愈伤组织上诱导的不定芽情况，统计诱导出芽率。

1.2.3 不定芽的伸长

以MS为基本培养基，采用不同NAA、6-BA和KT浓度组合配制不定芽伸长培养基，在愈伤组织诱导分化培养基为MS培养基+0.05mg·L-1NAA+2 mg·L-16-BA+3%蔗糖+0.8%琼脂，pH5.8条件下，选择生长状态良好的外植体接入到不定芽伸长培养基中，每种激素组合接种8瓶，每瓶培养基中接种5个外植体，接种的总个数均为40个。两周继代一次，30天后观察统计不定芽伸长情况。

2 结果与分析

2.1 种子消毒对种子萌发的影响

通过6个处理对亚麻种子进行消毒，随着乙醇浸泡时间及次氯酸钠消毒时间的增加，种子的萌发率呈下降趋势，种子消毒效果越来越好（表1）。相比于乙醇溶液中浸泡1min条件，在乙醇溶液中浸泡0.5min条件下虽然种子的平均发芽率整体水平较高，但种子带菌情况严重，造成种子材料的浪费，因此确定乙醇浸泡的时间为1min。随着次氯酸钠消毒时间的增加，种子的带菌情况减少，但平均发芽率也随之下降，因此综合种子萌发及消毒后种子带菌情况，确定种子放入10%次氯酸钠的消毒时间为20min。

表1 不同消毒时间对种子消毒及萌发的影响Tab.1 Effect of different times on seed disinfection and germination

2.2 不同激素配比对亚麻愈伤组织诱导及分化的影响

下胚轴接种于不同激素配比的愈伤组织诱导分化培养基中。经过诱导培养，下胚轴都能诱导出愈伤组织。但愈伤组织形成的时间有所不同，放入诱导分化培养基14d后，NAA浓度为0.05 mg·L-1条件下与NAA浓度为0.1mg·L-1条件下相比，愈伤组织的形成整体较快。诱导培养30天后（图1）统计含有不定芽的外植体并且计算诱导出芽率（表2），在NAA、BA和KT的不同浓度配比下，筛选出最适愈伤组织诱导分化培养基，即激素添加量为：NAA浓度为0.05 mg·L-1和6-BA浓度为2mg·L-1，此条件下愈伤组织形成较快、诱导出芽率较高并且每个愈伤组织上诱导出不定芽的数量较多。

表2 不同激素配比对愈伤组织分化的影响Tab.2 Effect of different hormone concentrations on callus differentiation

2.3 不同激素配比对不定芽伸长的影响

下胚轴进行30天诱导分化形成带有不定芽的愈伤组织，将外植体移至不定芽伸长培养基中进行培养，30天后统计愈伤组织上已伸长至1.5cm以上的植株数（图2）及相关外植体数。表3中相关数据表明，在NAA浓度0.05 mg·L-1、6-BA浓度1 mg·L-1和KT浓度1 mg·L-1条件下，外植体中平均伸长植株数较多，但外植体总数中含有伸长植株的外植体比例并不是最高；在NAA浓度0.1 mg·L-1和6-BA浓度1 mg·L-1条件下，外植体总数中含有伸长植株的外植体比例相比其它处理为最高。因此确定出最适不定芽伸长培养基中激素添加量为：NAA0.1 mg·L-1和6-BA 1mg·L-1。

表3 不同激素配比对不定芽伸长的影响Tab.3 Effect of different hormone concentrations on adventitious shoot elongation

3 讨论

获得无菌苗是进行亚麻组织培养及遗传转化的首要步骤，利用70%乙醇溶液浸泡后再经过10%次氯酸钠溶液消毒是亚麻种子消毒的一种常用方法。不同基因型的亚麻所需要的消毒时间不同[3]，这与本身种子的萌发情况及带菌情况相关，因此在确定种子消毒时间时应考虑萌发及污染两方面因素，即确保外植体材料具有足够的使用量，减少种子材料的浪费。

图1 不定芽的诱导Fig.1 Adventitious shoot induction

图2 不定芽的伸长Fig.2 Adventitious shoot elongation

植物组织培养中，常用的植物激素有NAA、6-BA、KT、IBA、2、4-D等[4]，不同浓度的激素配比对亚麻愈伤组织诱导及不定芽的诱导和伸长是有影响的，配制培养基时应综合考虑，协调植物激素间的组配比例及使用量，使植物组织培养得到相应的预期效果。根据本试验结果，愈伤组织诱导分化培养基以及不定芽伸长培养基中NAA和6-BA的配合使用及其浓度配比对不定芽的诱导及伸长起着重要作用。

4 结论

通过对亚麻品种黑亚14进行再生条件的优化研究，黑亚14的最适的种子消毒条件为70%乙醇浸泡1.0min，10%次氯酸钠消毒20min。最适愈伤组织诱导分化培养基为MS培养基+0.05mg·L-1NAA+2mg·L-16-BA+3%蔗糖+0.8%琼脂，pH5.8。最适不定芽伸长培养基为MS培养基+0.1mg·L-1NAA+1mg·L-16-BA+3%蔗糖+0.8%琼脂，pH5.8。

[1]姬妍茹.根癌农杆菌介导的亚麻遗传转化研究进展[J].黑龙江纺织,2008,3:(4-8).

[2]张志扬,陈信波,张瑜,等.亚麻组织培养高频不定芽诱导体系[J].植物学通报,2007,24(5):629-635.

[3]王克臣.亚麻离体再生及早期体细胞胚胎发生机理的研究[D].哈尔滨:东北农业大学,2008：109-110.

[4]王克臣,冷超,李明.亚麻离体再生体系的建立及优化[J].安徽农业科学,2010,38(14):7195-7199.