四川汉族血小板献血者HPA-9基因频率调查

蒿广德,刘 敏,齐文玲,蒲丽蓉

(广元市第一人民医院输血科,四川广元 628017）

随着成分输血的不断深入推广应用,血小板输血已成为临床输血治疗的重要手段之一,在血小板质量和数量存在问题的疾病治疗中发挥了重要的作用。人类血小板同种抗原(human platelet alloantigens,HPA）位于血小板膜糖蛋白上,这些蛋白是由遗传决定的,HPA的基因频率在不同种族、不同区域中的分布是不同的。在临床血小板输血过程中,如果血小板同种抗原不相匹配[1],可导致受血者机体产生血小板同种抗体,引起同种免疫血小板减少综合症、输血后紫癜、血小板输注无效等。目前检测出的24个HPA抗原中除HPA-14bw抗原是由于在核苷酸1901到1911位置上AAG等3个碱基缺失外,其他抗原均由于单核苷酸取代而产生。鉴于HPA在血小板输血中的重要意义,现对四川省广元市113名固定血小板献血员HPA-9进行基因分型,报告如下。

1 材料与方法

1.1 样本收集128名四川省广元市固定血小板献血者,汉族,相互之间无血缘关系。采集每个血小板供者300 μ l全血,EDTA 抗凝 。

1.2 试剂与仪器设备Bio-RAD my cycler PCR扩增仪(Bio-RAD,USA）,凝胶成像系统(UVP,USA）。

1.3 基因组DNA的提取按北京天根DNA提取试剂盒说明书操作提取DNA,每份标本溶解于30 μ l TB溶液中。

1.4 HPA-9基因分型HPA-9基因分型使用G&T公司试剂,HPA-9基因分型分为HPA-9a和HPA-9b基因检测,内对照是人类生长激素,产物大小为429 bp,HPA-9基因检测产物大小为196 bp。HPA-9基因分型基因检测根据PCR产物的有无以及产物是否是预期大小一致的片段来判断基因分型。根据说明书反应体系为 10 μ l,引物混合物 7 μ l,DNA1 μ l(20-50 ng）,Taq酶1 μ l(0.25 u）。扩增参数:按94℃变性3 min;94℃,30 s、60℃,30 s、72℃,90 s;30 个循环后72℃延伸5 min;4℃循环参数扩增。

1.5 电泳扩增结束后PCR产物 5 μ l在2%的琼脂糖内点样,使用0.5×TBE缓冲液中150V电泳20 min结束电泳,凝胶成像系统拍照记录结果。

1.6 统计分析基因频率是指一个群体中某类等位基因的数量占该基因位点上全部等位基因的比率。等位基因频率f(a）=[2×纯合子+杂合子]/[2×总个数],f(b）=1-f(a）;基因型频率是指一个群体中某一基因型的个体占群体中全部个体的比率。不同国家和地区人群间基因频率的比较采用统计软件SPSS 12.0进行χ2检验(精确概率法）,基因型之间的比较采用 χ2检验的构成比的比较。以P＜0.05为有差异,P＜0.01为有显著性差异。

2 结果

2.1 基因分型结果调查的128名四川广元汉族固定血小板供者基因分型结果全部是HPA-9aa,未检测到HPA-9bw,调查人群基因型分布结果符合Hardy-Weinberg定律[2]。该地区HPA-9的基因频率是1.0,HPA-9b的基因频率是0,见表1。

2.2 四川广元市汉族人群HPA-9基因频率与不同国家和地区人群调查比较 四川广元市汉族人群HPA-9基因频率与高加索人、台湾地区、上海汉族、潍坊汉族及邯郸汉族地区比较的结果P＞0.900[3-7],不存在差异,见表2。根据目前报道HPA-9基因分布呈单态性。

表1 四川广元市血小板固定献血员HPA-9基因分型

2.3 基因检测电泳结果图1中是4名四川广元地区固定血小板献血者的HPA-9基因检测结果,如图1所示。第一泳道为Marker,第二泳道和第三泳道是同一检测样本的HPA-9a、HPA-9b的基因检测结果,依此类推是第二个、第三个和第四个样本HPA-9基因检测结果。128名四川广元地区汉族基因分型结果均为HPA-9aa。

表2 四川广元汉族与不同国家地区HPA-9基因频率的比较

图1 4名四川广元地区固定血小板献血者的HPA-9基因检测结果

3 讨论

由于血小板特异性抗原的复杂性,所以很难获得特异性较高的单克隆抗体。HPA遗传多态性的分子背景已经十分清楚,是由于单核苷酸突变造成的,这为建立相应的基因检测方法成为可能。本研究通过PCR-SSP技术对128名血小板献血者进行基因分型,填补了四川广元地区人群HPA-9人类学资料,同时也为该地区血小板库的建立了增加一项重要指标。由于血小板上HPA的不同,在血小板输血、妊娠或骨髓移植等刺激下可以产生血小板抗体。在多次输血的患者中,约有8%的可能性产生血小板特异性抗体[8]。血小板抗体可造成血小板输注无效症、新生儿溶血病以及器官移植排斥反应等。国外曾报道过HPA-9bw的低频抗体[9],提示HPA-9的基因检测的重要性。当前我国对HPA-9抗原进行调查的较少。我国又是一个地域辽阔、人口众多的多民族国家,因此十分必要对HPA-9进行大规模的调查。本调查中没有发现HPA-9bw,在高加索人、台湾、上海汉族、潍坊汉族及邯郸汉族也未见HPA-9bw的报道,四川广元地区的HPA-9基因调查数据与上述地区没有显著差异。可能与调查人群数量均不大相关,此项目仍需进一步扩大人群数量进行调查。

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