纤维环穿刺法在建立椎间盘退变动物模型的实验研究

何 斌,杨 坚,彭方亮,李 锋

(1.华中科技大学同济医学院同济医院骨科,湖北武汉 430030;2.石河子大学医学院第一附属医院骨科, 832008）

腰椎间盘突出症是临床上影响人类健康的常见病和多发病,其病因及发病机制尚不清楚,大量研究表明椎间盘退变是主要原因之一[1]。而建立一种可靠的腰椎间盘突出动物模型为反复探讨及研究椎间盘退变的发病机制提供有利的条件进而发现有效的治疗方法。目前常构建椎间盘退变动物模型主要有应力型椎间盘突出动物模型、脊柱不稳导致椎间盘突出模型、纤维环切开法、纤维环穿刺法、终板损伤法、化学损伤型动物模型。近年来多人通过兔模型行纤维环针头穿刺,导致纤维环结构破坏,可观察到渐进性椎间盘退变征象,且重复性好、符合人类椎间盘退变的动物模型[2-4]。故本实验拟通过18G穿刺针刺入纤维环,破坏髓核组织,来建立动物椎间盘退变的模型,并通过X线、MRI检查、免疫组化观察椎间盘的细胞、基质形态、细胞数目和椎间盘Ⅱ型胶原含量的改变,以进一步确定是否能用此种方法来建立动物椎间盘退变模型及其退变的程度。

1 资料与方法

1.1 一般资料

成年新西兰大白兔24只,雌雄不限,体重2.2-2.6 kg,平均为2.35±0.24 kg。单笼饲养,喂食普通兔饲料,充足饮水,保持动物房清洁、干燥、安静、通风好及温度适宜。纳入标准:无明显全身免疫性疾病和慢性疾病感染,并经MRI检查确认无脊柱及椎间盘病变。模型组和对照组:以各只兔子的L5-6椎间盘为模型组,以L4-5椎间盘为自身对照组。

1.2 实验方法

用10%水合氯醛5 ml/kg耳缘静脉注射麻醉,备皮、消毒、铺巾,取左侧卧位固定,采用腰椎右侧前方入路,从右12肋骨底部到髂嵴之间做一切口,切开皮肤,筋膜,逐层钝性分离,于骶棘肌和腹外斜肌交界处打开腰背筋膜后层,分离腹外斜肌和后腹膜到横突,使用锐性加钝性剥离椎前软组织,暴露脊柱的右前外侧。以持针器夹持18G皮肤穿刺针头,尖端保留约5 mm长度,于纤维环前外侧方平行终板方向穿刺L5/6椎间盘(兔的腰数为7节）,刺入后维持5秒,然后拔除穿刺针,遂层缝合,关闭切口,敷以纱布,并给予庆大霉素8万单位肌肉注射。麻醉及术中兔子均无死亡。术后2-3小时兔子麻醉清醒,活动。当天兔即可进食,次日排便,4日后活动好。术后将动物随机分为4、8、4周3个模型组,每组8只,分笼饲养。分别在术后1周、2周、4周作X线和MRI检查后静脉注入空气致死。并取出L5-6髓核标本。置于10%甲醛溶液中,固定24小时后,制作石蜡切片,并同时取L4-5椎间盘组织作为对照组。

1.3 检测指标

1.3.1 X线检查 分别于术后1周、2周、4周行 X线检查。用Simens公司X线光机进行全脊柱正、侧位X线片,观察腰椎椎间隙狭窄退变征象,在显示器亮度、色度、对比度及清晰度恒定的条件下测量L4-5、L5-6椎间隙高度值,并求得模型组术前与术后高度值比、对照组术前与术后高度值比。

1.3.2 MRI检查 分别于术后1周、2周、4周行MRI检查。采用Simens公司1.5T超导型核磁共振扫描仪(MRI）检查。用自旋回波序列对腰椎行矢状位扫描和L1-S1椎间盘横轴位扫描,序列重复时间/回波时间T1加权像为 5000/96 ms,T2加权像为5 000/128 ms,层厚3 mm,层间距1 mm,观察椎间盘信号的改变。由放射科医生盲法阅片后诊断结果。将术后各阶段的成像结果进行影像资料的测量与分析L3-4、L4-5、L5-6整个椎间盘和其内呈高信号区域信号值。随机选取图像,每幅选取的图像均反复测量三次并取平均值,得到对照组、转染组和生理盐水组术前与术后信号值比。

1.3.3 Ⅱ型胶原免疫组化染色方法及步骤(SP法）实验标本制备成石蜡后,脱蜡、水化,用SP法发做Ⅱ型胶原免疫组化染色,脱水、透明、封片,显微镜观察结果。结果进行统计学分析。

1.3.4 统计学处理 数据采用SPSS13.0统计软件进行统计学处理。统计X线、MRI椎间隙高度的术前与术后高度值比在手术组和对照组间行t检验、方差分析。Ⅱ型胶原各周组内模型组与对照组之间计量资料使用均数±标准差,数据行单因素方差分析,再两两比较使用t检验,P＜0.05认为有统计学意义。

2 结果

2.1 X线影像学检查结果

术后1周、2周和4周,对照组腰段脊柱仅有2例椎间盘软骨终板钙化,1例椎间隙偶有轻微楔形样变,无狭窄及骨赘形成,而模型组在多个椎间盘观察到椎间隙楔形样变,椎间隙狭窄及骨赘形成严重。对L4-5、L5-6椎间隙高度前后高度比值比较的结果见表1和图1,每组动物有8只共24个椎体,样本量为24。可见模型组和对照组椎间隙高度值比在1周、2周和4周明显减低,呈进行性下降,差异均具有统计学意义(P＜0.05）,模型组椎间隙的降低程度随时间的延长这种变化有加重表现,差异具有统计学意义(P＜0.05）,对不同时期椎间隙高度值比的比较用配对t检验,模型组椎间隙高度于术后明显减低,而P＜0.05表示有统计学意义。

表1 模型组和对照组X线片椎间隙高度比值的比较(x-±s,n=24）

2.2 MRI影像学检查结果

术后1、2和4周兔腰椎MRI上可见,模型组髓核信号强度呈逐渐减弱趋势,椎间隙高度也有所下降,而对照组髓核信号强度基本无明显改变(结果见表2,图2）,说明髓核信号强度在模型组和对照组之间存在明显差异,(P＜0.01）,且其下降与造模后时间的长短有显著的关系,即造模后时间愈长,造模组髓核信号强度降低愈明显。

图1 模型组不同时期的X线图

表2 模型组和对照组MRI髓核信号强度的比较(x-±s,n=30）

图2 模型组不同时期的MRI图

2.3 免疫组化实验检测Ⅱ型胶原的表达

对照组(L4-5）组织基质呈强阳性染色,1周、2周、4周模型组(L5-6）组织基质分别呈弱阳性染色。测得1周、2周、4周Ⅱ型胶原表达经图象分析仪半定量测定(结果见表3）,采用t检验,说明髓核信号强度在针刺法破坏纤维环后染色程度明显降低,差异具有统计学意义,髓核信号强度下降与造模后时间的长短有显著的关系,即造模后时间愈长,造模组髓核信号强度降低愈明显。

表3 在对照组和对照组中Ⅱ型胶原蛋白的表达(x-±s,n=30）

3 讨论

人类腰椎间盘退变一直是人类研究的重点和热点,目前引起椎间盘退变的确切机制尚无定论。椎间盘退变起源于髓核、软骨终板和纤维环退变。髓核退变包括髓核细胞退变和髓核细胞外基质退变。学者们通过可重复性的实验动物,实施多种实验方法,可大大缩短实验周期,并为人们提供了一个研究的平台→有效治疗和预防椎间盘退变。人类疾病的动物模型(animal model of human disease）是指各种医学科学研究中建立的具有人类疾病模拟表现的动物。本课题的动物模型是指通过实验干预或自发过程,在实验动物活体内或体外模拟并观察分析椎间盘退变的过程。从而为椎间盘退变的病因学研究提供参考依据,进而对椎间盘退变的可能治疗方法或药物进行评估。

人类各种疾病的发生发展是十分复杂的,使用动物模型是现代生物医学研究中的一个极为重要的实验方法和手段,有助于更方便地认识人类疾病的发生、发展规律和研究防治措施。自Lob(1933）首次通过手术直接采用纤维环切开等方式制成羊椎间盘退变模型后,不同方法和不同物种的退变模型相继建立[5],灵长类、猪、犬等大型哺乳动物因动物实验伦理和经济因素等条件限制而难以大量应用[6,7],兔和鼠仍作为构建椎间盘退变模型的常规实验动物。本次动物模型的建立,选择兔作为动物模型,具有经济、便利的特点,比大鼠更易获取椎间盘及分离髓核组织、更能耐受手术创伤[8]。

本实验X线观察椎间隙变窄,椎体结构不稳,椎间盘上下软骨终板有不同程度的钙化,椎间隙狭窄严重,其模型组的椎间隙高度术前与术后比值明显低于对照组的高度值比,行统计学分析,其术后1周、2周和4周的差异均具有统计学意义,且模型组椎间隙的降低程度随时间的延长这种变化有加重表现。与相关文献认为X线片能够提供椎间盘高度降低、骨赘形成及椎间盘钙化等病变信息,其中椎间盘高度是定量分析椎间盘退变程度与相关文献相符[9]。MRI扫描已是椎间盘退变最简单最精确的检查手段,能在早期发现椎间盘退变。MRI的信号强度随着椎间盘组织含水量呈正相关。本研究显示术后1、2和4周模型组髓核MRI信号强度呈逐渐减弱趋势,椎间隙高度也有所下降,而对照组髓核信号强度基本无明显改变,其差异经统计学分析有统计学意义,也随时间呈逐渐加重。有研究显示椎间盘退变,主要表现在椎间盘干瘪、变薄,髓核中心不同程度的纤维化、钙化、髓核严重皱缩。本实验中纤维环穿刺组术后MRI检查,椎间隙开始变窄,代表含水量的T2信号强度减弱并有椎间隙狭窄。椎间盘MRI图像可作为椎间盘退变非常有价值、客观的诊断依据之一[10]。

综上所述,尽管损伤所诱导的椎间盘退变动物模型,在发病机制上与人类椎间盘退行性变尚有一定差异,但过这个方法制成的兔椎间盘退变模型与人类具有相同的生化及病理过程,可以作为椎间盘退变研究的动物模型,仍可为该类研究提供相关研究的实验载体。相关研究显示当椎间盘发生退变时,整个椎间盘的Ⅱ型胶原一直下降,这是一个总的趋势,此改变与椎间盘退变程度呈正相关[11]。

本研究认为对照组(L4-5）组织基质呈强阳性染色,1周、2周、4周实验组(L5-6）组织基质分别呈弱阳性染色,经图象分析仪半定量测定并分析,说明髓核信号强度在针刺法破坏纤维环后染色程度明显降低,差异具有统计学意义,髓核信号强度下降与造模后时间的长短有显著的关系,即造模后时间愈长,造模组髓核信号强度降低愈明显。原因可能是髓核组织中Ⅱ型胶原的含量逐渐减少,随着Ⅱ型胶原的减少,使椎间盘组织硬度增加,失去均匀传递压力的作用,从而反复主要作用于某个点,使得纤维环薄弱处受力增加,易使该处纤维环破裂、变性髓核脱出。综上所述,本实验通过纤维环穿刺法成功诱导兔腰椎间盘的退变,这种退变可随时间延长呈现进行性加重的过程,完全符合人类椎间盘的演变过程。本研究认为大白兔可作为椎间盘退变研究的动物模型,并为椎间盘退变研究提供大样本的实验可能。

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