NGF预处理对AMI大鼠心肌VEGF及其受体KDR/flk-1表达的影响

李 颖,孙 新,郭华涛,熊 英,翟羽佳,徐 雷

(北华大学1.附属医院心内科,2.生命科学中心,吉林 吉林市 132011）

近年来研究发现神经生长因子(NGF）家族及其受体在心血管系统中存在广泛表达,并参与多种心脏疾病的病理生理过程。我们前期的研究表明[1],外源性给予NGF可有效地保护大鼠心脏交感神经支配,可维持一定数量的神经元存活,使心肌损伤坏死面积减少。NGF还可促进心脏缺血组织的血管形成。我们拟研究NGF预处理对大鼠心肌VEGF及其受体KDR/flk-1表达的影响,探讨NGF对心肌损伤修复的保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物分组及模型建立雄性成年Wistar大鼠60只,随机分为3组:NGF预处理组和非NGF预处理组和对照组(每组20只）。大鼠NGF预处理使用注射用鼠神经生长因子(0.5 μ g/kg）尾静脉注射。采用结扎左冠状动脉前降支制作大鼠急性心肌梗死动物模型。于手术后7天取材。乙醚麻醉下处死动物,大鼠股动脉采血,取大鼠心肌组织,分别做常规石蜡包埋和即刻液氮冷藏。

1.2 试剂注射用鼠神经生长因子购自武汉海特生物制药股份有限公司;Trizol为美国Invitrogen公司产品;RNA PCRKit(AMV）Ver.3.0试剂盒购自宝生物工程(大连）有限公司;血管内皮生长因子(VEGF）及其受体KDR/flk-1 PCR引物由上海英俊生物科技有限公司合成。VEGF引物(495 bp）,上游:5′-tggctttactgctgtacctcc-3′,下游 :5′-acaaatgctttctccgctct-3′;KDR/flk-1 引物(418 bp）,上游 :5′-tcacggttgggctactgc-3′,下游:5′-agaccttctgccatcacg-3′;内参 GAPDH 引物 (139 bp）,上游:5′-tatcggacgcctggttac-3′,下游:5′-ctgtgccgttgaacttgc-3′。

1.3 方法

1.3.1 心肌组织病理切片观察:取心肌标本制作石蜡切片,HE染色后观察形态学改变。心肌损伤程度用专用显微镜测量及Motic Imaging Previmer医学图像分析系统进行结果分析。选择单点彩色分割(放大倍数为66倍）测定心肌坏死灶面积占心肌总面积的百分数(面密度,%）。

1.3.2 RT-PCR法检测大鼠心肌组织中VEGF、KDR/flk-1 mRNA表达:Trizol一步法提取冻存心肌总RNA,按TaKaRa RNA PCR Kit(AMV）Ver.3.0试剂盒说明操作,合成并扩增cDNA。扩增反应条件:预变性94℃,4 min;变性 94℃,30 s,退火 54℃(VEGF、KDR/flk-1）、55℃(GAPDH）,30 s,延伸 72℃,45 s,30个循环;终末延伸72℃,7 min。以Fermentas公司的Gene RulerTM 100 bp DNA Ladder为Marker。用Kodak Digital Science 1D系统进行图像扫描分析,测定大鼠心肌组织中VEGF、KDR/flk-1 mRNA表达水平。

1.4 统计学处理实验结果为计量资料,数据以¯x±s表示,用SPSS 14.0软件进行统计分析。正态分布数据采用方差分析(One-Way ANOVA）,两组间比较采用t检验、多组间两两比较采用q检验。两变量之间的关系应用一元线性相关分析。α=0.05作为差异具有统计学显著意义的标准。

2 结果

2.1 大鼠心肌组织的病理变化正常对照组大鼠心肌组织病理切片观察未见异常。非NGF预处理组大鼠心肌组织损伤、坏死的部位主要在左心室游离壁、心内膜下心肌和心尖部等处。可见大片状坏死和多发灶状坏死,坏死中心心肌细胞崩解消失,并有大量炎细胞浸润。NGF预处理组大鼠心肌损伤程度轻,坏死面积小,多呈小灶状和条状,局部有少量炎细胞浸润,二者比较差异具有统计学显著意义(P＜0.01）。见表1。

表1 大鼠心肌坏死面积病理检测结果比较(±s）

表1 大鼠心肌坏死面积病理检测结果比较(±s）

注:*与非NGF组比较,P＜0.01;

组别 n 心肌坏死面积(%）NGF组 20 25.41±9.06*非NGF组 20 40.08±11.38

2.2 大鼠心肌组织中VEGF和KDR/flk-1的mR-NA表达大鼠心肌VEGF mRNA扩增产物电泳可见3个条带(260-500 bp）,对应VEGF的三个亚型VEGF120、VEGF164 和 VEGF188。VEGF mRNA 和KDR/flk-1的mRNA(407 bp）的表达在对照组的表达水平很低,心梗后升高,NGF预处理组也高于非NGF预处理组(P＜0.01）;各实验组大鼠心肌中VEGF和KDR/flk-1mRNA表达光密度比值的统计结果见表2。

表2 各组大鼠心肌中VEGF和KDR/flk-1 mRNA表达结果比较(±s,%）

表2 各组大鼠心肌中VEGF和KDR/flk-1 mRNA表达结果比较(±s,%）

注:*与非NGF组比较,P＜0.01.

组别 n VEGF/GAPDH KDR/flk-1/GAPDH对照组 20 4.06±3.07 5.18±4.76 NGF组 20 45.41±11.54* 47.40±7.83*非NGF组 20 32.34±8.10 31.08±7.88

2.3 相关分析大鼠心肌VEGF mRNA表达与KDR/flk-1mRNA表达之间呈正相关关系(r=0.691,P＜0.01）。说明大鼠心肌中VEGF mRNA表达与KDR/flk-1mRNA表达同步上调。

3 讨论

我们的结果表明,NGF预处理组大鼠心肌损伤程度轻,坏死面积小。对照组大鼠心肌中VEGF及其受体KDR/flk-1的表达水平都很低,心梗后其表达水平上调,NGF预处理组更是明显高于非NGF预处理组。NGF预处理可能通过上调VEGF水平促进血管新生,减轻大鼠心肌损伤,从而产生保护作用。Calza等[2]通过对新生大鼠颈上神经节(SCG）的研究发现,NGF不仅可促进SCG内神经元的发育,而且SCG内的血管内皮细胞肥大、增生,血管床面积增大,进一步研究发现SCG内的VEGF表达也增多。在外周神经,NGF也同样可通过促进VEGF的表达,间接地促进血管形成[3]。Turrini等[4]将狗的股动脉阻断后,后肢的内收肌和腓肠肌缺血,结果NGF及其受体表达上调,缺血肢体微动脉的形成较对照组增加90%以上。可见这种内源性的NGF释放增加不仅与神经保护和神经修复作用相关,还可促进缺血组织血管形成。体内、外实验均证实NGF可促进局部缺血组织的血管形成[5,6,7]。我们的结果与此一致,也是在微血管及其周围表达丰富。进一步研究发现,心肌缺血时VEGF表达增加可促进侧支循环的建立[8]。编码VEGF-165的裸露质粒DNA,注射到急性心肌梗死病人的缺血心肌部位,结果发现症状减轻,心肌血管管径增加[9]。VEGF还有可能促进心肌细胞的再生[10]。有研究发现,KDR/flk-1和具有活力的心肌组织相关,心梗急性期KDR/flk-1表达下降[11]。本研究中正常对照组的KDR/flk-1的表达很低,而心梗后其表达升高,并没有表现出急性损伤时的下降,可能是因为我们的研究中并没有将坏死区域与正常心肌进行比较,而是对整个心脏的综合指数进行分析;我们的结果显示,VEGF和KDR/flk-1mRNA表达呈正相关,VEGF与其受体平行上调可增加心肌新生血管密度从而产生心肌保护作用。

由于啮齿类动物与高级大型动物之间的差异,以及NGF剂量和干预时间的不同,NGF在心血管病临床应用方面还需进一步深入研究。

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