不同浓度五味子乙素对脑胶质瘤SHG-44细胞增殖的影响

金 宏,温 娜,纪鹏艳,王 爽,王树东,齐 玲*

(1.吉林医药学院实验中心,吉林吉林市 132013;2.吉林大学第一医院心血管中心）

脑肿瘤发病率目前在全球范围内呈上升趋势,脑肿瘤中以胶质瘤最为常见,恶性胶质瘤是肿瘤患者的第4位死亡原因,具有发病率、复发率、死亡率高和治愈率低“三高一低”的特点。研究表明,五味子具有保肝、抗肿瘤、抗氧化与抗衰老等作用,但目前对于五味子的研究都主要集中在保肝作用方面,五味子在脑肿瘤中治疗作用少有研究。本研究观察了五味子乙素(Schisandrin B,Sch B）对体外培养脑胶质瘤SHG-44细胞生长的作用,旨在探讨五味子乙素在脑肿瘤细胞生长中起到的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞株脑胶质瘤SHG-44细胞由吉林大学提供。

1.2 主要试剂细胞培养基RPMI-1640(Thermo）,小牛血清(Gibco）,五味子乙素(中国药品生物制品检定所）,胰蛋白酶(Gibco）,四甲基偶氮唑(MTT）(Sigma）,二甲基亚砜(DMSO）(Thermo）。

1.3 脑胶质瘤 SHG-44细胞的培养从液氮中取出冻存的脑胶质瘤SHG-44细胞,迅速放入37℃水浴箱中复苏,然后将细胞接种于培养瓶中,加入10 ml含10%小牛血清的RPMI-1640细胞培养液,将其置入37℃、5%CO2细胞培养箱中培养,隔日换液。

1.4 药物作用后 SHG-44细胞生长情况检测将五味子乙素用85%乙醇溶解后,取适量药液加入含5%小牛血清RPMI-1640细胞培养液,配制成终浓度为 0,50,100,200 μ l◦ml-1的药物。取对数生长期的脑胶质瘤SHG-44细胞,用胰酶消化后,用含5%小牛血清RPMI-1640细胞培养液调整细胞浓度为1×106ml-1。将细胞悬液均匀接种于96孔板中,每孔100 μ l,置入 37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养 24 h,使细胞同步化。分别于24、48、72 h弃去上清液,加入含不同浓度的五味子乙素,每个药物浓度重复5次。药物作用结束时,每孔加入MTT20 μ l,37℃继续孵育4 h,终止细胞培养,弃去上清液,每孔分别加DMSO 150μ l,震荡均匀使MTT沉淀完全溶解,15 min后在酶联免疫检测仪上490 nm波长处测定各孔吸光度(A）值,用不加细胞的空白孔调零。

1.5 统计学处理所有数据以¯x±s表示,组间比较用t检验。

2 结果

2.1 五味子乙素对体外培养脑胶质瘤细胞生长的影响用不同浓度五味子乙素作用于SHG-44细胞,结果显示:药物在最初作用的24 h内,对细胞生长起到了轻度的刺激作用,细胞增殖明显(P＜0.05）。随着药物作用时间的增加,药物作用48 h时,对细胞开始呈现明显的抑制作用(P＜0.05）,72 h时作用最为明显(P＜0.01）。说明五味子乙素在短时间内促进细胞增殖,而48 h及以上时间,则抑制细胞生长,并具有一定的时间和剂量关系。

表1 不同浓度 Sch B对 SHG-44细胞的作用(OD值）

3 讨论

Sch B属木脂素类,它是五味子的主要活性成分之一。五味子抗肿瘤作用主要集中在木脂素和多糖部位[1]。其中,Sch B是其抗肿瘤的主要成分之一。Sch B具有毒性小的特点[2]。用五味子乙素单药处理对SMMC7721无毒性作用[3]。Sch B发挥抗肿瘤作用主要是通过清除氧自由基、诱导肿瘤细胞分化及凋亡、逆转肿瘤细胞多耐药性、抑制肿瘤血管生成等机制来抑制肿瘤的生长及转移。目前对五味子粗提物药理作用的研究较多,但对五味子乙素的抗肿瘤机制研究还不够系统、深入。

Sch B可以通过凋亡早期发生Caspase-3依赖性途径和Caspase-9非依赖性途径诱导人肝癌SMMC-7721细胞发生凋亡[4]。Sch B和顺铂单独应用可导致H22肝癌移植瘤细胞中 caspase-3、8、9表达增高,联合应用时caspase-3、8、9表达增高更明显[5]。顾颖等[3]证实,Sch B所促进的凋亡是Caspases依赖型的。Sch B能够显著促进阿霉素在人肝癌细胞系SMMC7721诱导的凋亡,并证实这种凋亡是通过caspase-9的激活介导的[6]。

诱导肿瘤细胞凋亡是治疗肿瘤的重要方法。本实验观察了不同浓度、不同时间五味子乙素对体外培养脑胶质瘤SHG-44细胞生长的影响,结果发现较高浓度五味子乙素长时间作用脑胶质瘤SHG-44细胞后,可以诱导肿瘤细胞死亡,对细胞生长具有明显的抑制作用。在药物作用24 h时,细胞表现为增殖,而48 h和72 h时,则表现为明显的抑制作用,并有明显的时间和剂量效应。但Sch B呈现这种明显的双效反应,需要进一步研究其作用机制,明确药物作用的有效浓度和时间,以及发生双效反应的机制。这从另一侧面提示我们,在用五味子乙素进行治疗肿瘤时,一定要注意药物的剂量和治疗时间的长短。

总之,五味子乙素可能通过不同途径发挥其抗肿瘤的作用,本实验用MTT法检测到五味子乙素高浓度和长时间作用下明显抑制体外脑胶质瘤细胞的增殖,说明该药在诱导脑胶质瘤细胞凋亡方面发挥一定的作用,进一步肯定了五味子乙素在抗肿瘤方面的应用价值。下一步,本实验将在此研究的基础上,继续探索五味子乙素在诱导脑胶质瘤细胞凋亡的机制。

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