VEGF重组质粒转染骨髓间充质干细胞及表达的检测

崔可赜,张明磊

(1.海口市人民医院 骨科,海南 海口 570208;2.吉林大学中日联谊医院 骨科,吉林 长春 130021）

当细胞植入体内后,必须尽快发生血管化,建立血液循环,通过血液-细胞间液使细胞获得营养及氧气,维持其活力,进而发挥成骨作用,修复骨缺损。充分的血液供应是保证细胞在体内存活的决定性因素。在应用大块组织工程骨修复骨缺损时,其核心部位往往发生缺血性坏死,其原因是不能实现早期的血管化,导致支架中心的细胞因无法进行正常的新陈代谢而大量死亡[1]。有研究表明,植入体内后,远离毛细血管200 μ m以上的细胞将因为得不到营养和氧气而死亡,限制了在临床上的应用[2]。血管化已经成为骨组织工程的关键技术,能够将氧气及营养物质携带到局部微环境中,带走新陈代谢产生的废物及坏死分解产物,以维持一个动态的局部微环境。

1 材料和方法

1.1 材料pEGFP-N1/VEGF真核表达质粒,LIPofectamineTM脂质体转染试剂盒(Gibco公司）,DMEM培养基(美国Gibco公司）,胎牛血清(美国Hyclone公司）,SP免疫组化试剂盒、DAB,兔抗人VEGF抗体(Santa Cruz）。

1.2 方法

1.2.1 细胞的转染 转染前一天,采用胰酶消化法将处于对数生长期的细胞制备成单个细胞液,计数后调整细胞浓度为2×105细胞/ml,接种于6孔板,每孔2 ml。次日细胞融合铺满板底80%左右时进行转染。转染采用LIPofect-amineTM试剂盒进行。

1.2.2 转染后的观察及计算转染率 细胞转染48小时,光镜和荧光显微镜下观察细胞转染后荧光表达情况。

转染效率计算:10个视野转染阳性细胞数之和/细胞总数之和=该孔细胞转染效率。

1.2.3 ELISA方法检测BMP-2的表达 分别于1 d、4 d、7 d、10 d 、15 d、21 d 采用 ELISA 方法检测转染了各组质粒的BMSCs培养液中VEGF蛋白的表达。

1.2.4 免疫组织化学染色 细胞以1×105/mL、2 mL/孔,接种于铺有经多聚赖氨酸处理过的盖玻片的24孔培养板中,培养24 h。PBS轻洗3次,4%的多聚甲醛4℃固定,血清封闭,室温孵育10 min。倾去血清,滴加抗体,滴加 50 μ l生物素标记的1∶100稀释的二抗,37℃孵育30 min,PBS冲洗,滴加50 μ l新配置的DAB显色剂溶液,显色后,自来水冲洗,苏木素复染。梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。

2 结果

2.1 荧光显微镜下观察

荧光显微镜下观察,pEGFP-Nl/VEGF转染组发出绿色荧光。通过计算,转染率为40.1%,见图1。

2.2 ELISA方法检测VEGF

结果显示正常BMSCs及VEGF转染组均有目的蛋白的分泌,对两组组间进行统计学分析,BMP-2转染组与正常细胞有显著性差别(P＜0.05）。

表1 各组平均VEGF(pg/ml）

2.3 免疫组化染色

显微镜下观察,转染组细胞中均可见深棕黄色染色。提示BMP-2基因转染后在细胞中表达目的基因,并促进成骨方向转化,见图2。

2.4 RT-PCR结果

利用RT-PCR检测细胞的mRNA表达,在相应分子量处出现条带,说明目的基因在细胞中高表达。见图3。

图1 质粒转染后的荧光照片×200

图2 VEGF免疫组化染色×200

图3 RT-PCR结果

3 讨论

血管再生的形态发生过程有几个基本步骤[3]:(1）血管的舒张,相邻细胞间的接触减少,生长因子的作用下EC被激活;(2）EC增殖;(3）大量蛋白溶解酶分泌激活,降解血管基底膜,形成新血管的芽突;(4）形成细胞外基质,血浆和血浆蛋白从血管中外渗,其中含有的纤维素和纤维粘连蛋白形成胶样物质,沉积在细胞外间质内,对血管内皮细胞起到支架作用;(5）EC形成血管样结构(6）血管的成熟和改建,新生血管在蛋白酶的作用下,管壁逐渐增厚,弹性增加;(7）平滑肌细胞、成纤维细胞等参与使血管定型。血管内皮细胞在血管再生的过程中起到重要的作用,因此,血管化的关键环节是内皮细胞的增殖、分化、迁移和聚集。

VEGF是一种糖蛋白,具有特异性促血管内皮细胞生长和血管生成诱导作用的因子[4],在骨愈合过程中具有重要作用,其与血管内皮细胞表面的特异性受体结合,一方面可以促进内皮细胞增殖、迁移;另一方面增加局部毛细血管通透性,使纤维蛋白原渗出,于周边形成凝胶样基质,可支持并诱导毛细血管长入[5]。

VEGF作为旁分泌因子参与骨的形成与代谢[6],并在骨折的修复、塑型和改造过程中发挥作用,对骨形成及修复起到正性调节作用[7]。Spector[8]发现VEGF能引发成骨细胞的迁移及分化,且引起成骨细胞迁移及分化所需的浓度比BMP-2还低100倍。VEGF对原始成骨细胞有趋化迁移作用,对骨的形成和重建有功能性的作用[9]。

[1]Griffith LG,Naughton G.Tissue engineering-current challenges and expanding opportunities[J].Science,2002,295(5557）:1009.

[2]Niklason LE,Langer RS.Advances in tissue engineering of blood vessels and other tissues[J].Transpl Immunol,1997,5(4）:303.

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[9]Mayr-Wohlfart U,Waltenberger J,Hausser H,et al.Vascular endothelial growth factor stimulates chemotactic migration of primary human osteoblasts[J].Bone,2002,30(3）:472.