Box-Behnken中心组合设计法优化达卡巴嗪脂质体制备工艺

程桂茹, 王淑娟, 邹 岩, 张 龙

(长春工业大学化学工程学院,吉林长春 130012)

0 引 言

达卡巴嗪(DTIC),化学名称为5-(3,3-二甲基-1-三氮烯基)-4-酰胺基咪唑枸橼酸盐,是一种新型抗肿瘤药物,临床用于恶性黑色素瘤的治疗,对肺鳞癌和未分化癌、平滑肌肉瘤、纤维肉瘤等亦有一些治疗作用[1-3],但由于达卡巴嗪遇光或热易变化,在水中不稳定,限制了它的使用。如将DT IC包封在脂质体中,不仅扩大了DTIC的使用范围,而且提高了疗效。脂质体作为药物载体,可以减小药物剂量,降低药物的毒性,减小副作用,具有靶向性[4-5]。文中采用Box-Behnken中心组合设计[6],响应面分析法优化DTIC脂质体制备工艺条件,为更好地应用DTIC提供了理论依据。

1 材 料

1.1 药品与试剂

DTIC,长春一心药业公司;

大豆卵磷脂,天津市光复精细化工研究所;

胆固醇,天津市光复精细化工研究所;

三氯甲烷,天津天泰精细化学品有限公司;

磷酸氢二钠,天津市福晨化学试剂厂;

磷酸二氢钠,北京化工厂。

1.2 仪器

UV754N型紫外分光光度计,上海精密科学仪器有限公司;

AL104型电子天平,梅特勒-托利多仪器有限公司;

203型旋转蒸发器,上海豫康科教仪器设备有限公司;

KQ3200型超声波清洗器,昆山市超声仪器有限公司;

JXA840型透射电子显微镜,日本JEOL公司;

THZ-82型汽浴恒温振荡器,江苏金坛市金城国盛实验仪器厂。

2 方 法

2.1 DTIC含量的测定

2.1.1 紫外最大吸收波长测定

配制0.5 mg/mL的DTIC磷酸盐缓冲液(pH值 7.4,简称 PBS)的标准液,并稀释至0.02 mg/mL,在紫外光区(UV)与可见光区(VIS)作全波长扫描190～500 nm,确定最大吸收的波长为320 nm。

2.1.2 标准曲线

精密称取 25 mg DTIC用PBS溶解,并用50 mL容量瓶定容,配成0.5 mg/mL的标准液。用取液器分别量取0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0和1.2 mL于50 mL容量瓶中,再用磷酸盐缓冲液定容,其浓度分别为0.0005,0.004,0.008,0.012,0.016,0.020 mg/mL。以磷酸盐缓冲液为空白,在最大吸收波长下测定吸收值,将药物浓度与吸光度进行直线回归,得回归方程:

2.2 脂质体的制备

采用逆相蒸发法:将适量的磷脂与0.125 g胆固醇溶解在适量的氯仿中,再将0.01 g DTIC溶解在适量 PBS中,将上述溶液于旋干瓶中混合,水浴超声,减压蒸发除去有机溶剂,达到胶态后,滴加5 mL磷酸盐缓冲液,旋转帮助器壁上的凝胶水化脱落,然后在减压下继续蒸发,制得水性混悬液,通过透析除去未包封的药物,即得到7 mL大单层脂质体。

2.3 脂质体包封率的测定

分别取1 mL DTIC脂质体及空白脂质体装入透析袋内,置于盛有40 mL PBS的烧杯内,磁力搅拌,透析2 h。取透析液按药物含量测定中所述的采用紫外分光光度法测定,计算出游离药物的含量[7-8]。

2.4 响应面实验设计

在单因素实验的基础上,选择对包封率影响较为显著的3个因素作为考察对象,即大豆卵磷脂与胆固醇质量比(X1),水浴超声时间(X2),PBS体积(X3),根据单因素试验结果以及在最高或最低水平时制备DTIC脂质体的可行性,综合选择各因素的水平。

因素及水平的设计见表1。

表1 实验因素水平表

2.5 形态学研究

取少量DTIC脂质体制剂加蒸馏水稀释,超声波分散,再滴至专用铜网上,自然挥发,使粒子在铜网上浓缩沉积,用透射电子显微镜观察并照相。

2.6 脂质体的释药性曲线

取1 mL DTIC脂质体和空白脂质体装入透析袋内,置于50 mL磷酸盐缓冲液中透析,同时取1 mL DTIC脂质体溶液(16 mg/mL)于透析袋中,在50 mL磷酸盐缓冲液中同时透析以做对比,透析温度(37±0.5) ℃,于气浴振荡器中进行,定时取样10 mL,同时补加10 mL磷酸盐缓冲液,采用紫外分光光度计测定不同时间透析液中药物的含量。

3 结果与讨论

3.1 响应面分析

根据 Box-Behnken中心组合设计原理,以X1,X2,X3这3个因素为自变量,以脂质体的包封率为响应值,做3因素3水平的响应面分析设计实验,所需实验次数为12次。为了考察实验误差的大小,将中心点的实验重复进行了3次,实验设计与结果见表2。

利用Minitab软件对表2数据进行多元回归拟合,得到DTIC脂质体的包封率对大豆卵磷脂与胆固醇用量比、超声时间、PBS用量的二次多项回归模型为:

表2 DTIC脂质体的试验设计与试验结果

对该模型进行显著性检验,回归模型方差分析结果见表3。

表3 DTIC脂质体包封率的回归模型方差分析

由表3可知,P=0.001＜0.01,表明回归模型显著;F=0.97＞0.05,P=0.545＞0.05,不显著;复相关系数R为0.99795,说明该模型拟合程度良好,试验误差小,可以用此模型来分析和预测DTIC脂质体的制备工艺结果。

回归模型系数显著性检验结果见表4。

表4 DTIC脂质体包封率回归模型系数显著性检验结果

由表4回归模型系数显著性检验结果可知,模型的一次项X1极显著,X2,X3不显著;二次项X21,X22,X23极显著;交互项 X1X2显著,其它交互项不显著;表明各影响因素对于DTIC脂质体的包封率的影响不是简单的线性关系。

表5 回归分析

表5中的R-Sq的预测和调整数值相差不大,而且接近1。S数值不大,满足拟合要求。所以,该模型可用于三磷酸胞苷二钠脂质体制备工艺优化的理论预测。

3.1.1 响应面优化

超声时间、磷酸盐缓冲液的用量及其交互作用对达卡巴嗪脂质体包封率影响的曲面和等值线如图1所示。

由图1可知,在PBS用量为7.0～8.0 mL,超声时间在4～5 min的范围内,包封率不断增加,之后随着磷酸盐缓冲液的用量和超声时间的延长,包封率有下降的趋势。

图1 Y=f(X2,X3)的响应曲面及其等值线

超声时间、大豆卵磷脂与胆固醇用量比及其交互作用对达卡巴嗪脂质体包封率影响的曲面和等值线如图2所示。

由图2可知,大豆卵磷脂与胆固醇用量比对包封率的影响显著,表现为曲线较陡,当大豆卵磷脂与胆固醇用量比处于5.2左右时,包封率出现极值。

图2 Y=f(X1,X2)的响应曲面及其等值线

磷酸盐缓冲液的用量、大豆卵磷脂与胆固醇用量比及其交互作用对达卡巴嗪脂质体包封率影响的曲面和等值线如图3所示。

图3 Y=f(X1,X3)的响应曲面及其等值线

由图3可知,在PBS用量为7.0～8.0 mL和大豆卵磷脂与胆固醇用量比为4～5的范围内,包封率不断增加,之后随着PBS用量和大豆卵磷脂与胆固醇用量的增大,包封率有下降的趋势。

等值线图的形状可反映出交互效应的强弱,椭圆形表示两因素交互作用显著,而圆形则与之相反。由图1～图3等值线图可以看出,超声时间和大豆卵磷脂与胆固醇用量比之间的交互作用显著,表现为等高线呈椭圆形。相比较而言,PBS用量和超声时间之间,以及大豆卵磷脂与胆固醇用量比和PBS用量之间的交互作用较小。

比较图1～图3可知,大豆卵磷脂与胆固醇用量比对包封率的影响最为显著,表现为曲线较陡,最佳值在5.2附近;而超声时间和PBS用量对包封率影响次之,表现为曲线较平滑,且随着数值增加或减少,响应值变化较小。

为进一步确定最高点,对回归模型取一阶偏导数等于零,得到:

解方程得到:

变换为真实值可得大豆卵磷脂与胆固醇用量比为 5.01,PBS用量为8.04 mL,超声时间为5.2 min。在此条件下,预测DTIC脂质体的包封率为94.18%。

3.1.2 验证实验

在此条件下平行制备脂质体5次,实际测得的平均包封率为94.20%,与理论预测值相比,其相对误差为0.02%。因此,基于响应曲面法所得的优化制备工艺参数准确可靠。

3.2 脂质体的释药性曲线

实验数据如图4所示。

由图4可知,DTIC的脂质体突释是由未包封的 DTIC从透析膜透过的结果,脂质体在40 min以后平稳释放药物。

图4 达卡巴嗪脂质体的药物释放曲线

3.3 DTIC脂质体的形态和粒径观察

经逆相蒸发法制备的脂质体为乳白色悬液,电镜下观察照片为圆形或类圆形小体,脂质体或分散存在或聚集在一起。达卡巴嗪脂质体是粒径均匀的球形或近球状的小囊泡。粒径测定结果表明,平均粒径在50 nm左右。电镜照片如图5所示。

图5 DTIC脂质体的透射电镜照片(放大倍数 ×10 K)

4 结 语

基于实验设计,通过二次回归设计得到了DT IC脂质体的包封率与大豆卵磷脂及胆固醇用量比、PBS用量和超声时间关系的回归模型,经检验证明,该模型是合理可靠的,能够较好地预测DT IC脂质体的包封率。

利用模型的响应面及其等值线,对影响DT IC脂质体的包封率的关键因素及其相互作用进行探讨,得到的优化工艺参数为:大豆卵磷脂与胆固醇用量比为5.01,PBS用量为8.02 mL,超声时间为 5 min。脂质体的包封率为94.18%。实测值为94.20%,仅差0.02%,因此,利用响应面分析的方法对脂质体的制备工艺进行优化,可获得最优的工艺参数,预测工艺条件与实际工艺条件之间具有较好的拟合度,Box-Behnken中心组合设计可以应用于DT IC脂质体工艺条件的筛选。

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