溶藻细菌溶藻活性物质的研究进展

魏雅冬，王双侠，戴 明，王广慧，张腾霄，李 贺

（绥化学院，黑龙江绥化152061）

随着社会经济的快速发展，环境污染日益严重。其中最突出的就是含磷工业废水大量排放，导致藻类过度繁殖，水体富营养化现象加重，水华和赤潮现象不断发生。藻类大量产生会影响水体的性质，还能使水体环境恶化。进入20世纪以来，我国淡水的水体富营养化现象日益加重，70%的天然淡水湖泊都存在不同程度的富营养化污染现象。因此，去除藻类危害是亟待解决的问题。目前，治理水华和赤潮普遍采用传统的物理和化学方法，效果不理想且易造成二次污染。细菌溶藻得到了广泛关注。文献报道较多的是细菌分泌胞外物质到环境中抑制藻的生长，导致藻细胞溶解[1]。因此通过筛选溶藻细菌来提取其溶藻活性物质成为一个新的研究思路。溶藻细菌的研究在国外已有数十年历史，最早(1924)发现的溶藻细菌是粘细菌属(Myxobacter)，随后国内外一些文献又有报道如中性柠檬酸菌 (Cltrobacter intermedius)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)等对众多藻类均有一定的抑制、溶解、毒害或杀伤作用[2]。目前，国内在溶藻细菌及其溶藻活性物质方面的研究刚刚起步。在微生物中细菌的数量占大多数，而且分离研究也比较容易，因此溶藻细菌在治理水体富营养化方面会有广阔的发展前景。

1 溶藻细菌溶藻活性物质的作用方式

溶藻细菌是指通过直接或间接方式，抑制藻类生长或杀死藻类、溶解藻细胞的细菌的统称[3]。溶藻细菌对藻细胞的作用方式主要有两种：一是直接溶藻，即细菌与藻细胞直接接触或侵入藻细胞使之遭到破坏；二是间接杀藻，主要体现在细菌分泌特殊活性物质抑制藻类生长。后者被认为是细菌溶藻的主要方式。对溶藻细菌作用方式的研究一方面可以知道其作用机理，另外还能对生物杀藻剂的研制有理论指导作用。

2 溶藻细菌溶藻活性物质的种类

溶藻细菌可以通过释放特异性或非特异性胞外物质，如氨基酸、多肽、蛋白质、抗生素和羟胺等杀死藻细胞。这类细菌常见的有粘细菌（Myxobacter）、弧菌（Vibrio）、假单胞菌（Pseudomonas）、黄杆菌（Flavobacterium）、交替单胞菌（Alteromonas）等。目前报道的细菌溶藻物质主要有以下几类：

2.1 氨基酸

Yoshikawa[4]从日本一些岛采集水样，筛选具有抗蓝藻（Cyanobacteria）活性的细菌。共筛选出2594株细菌，其中仅有37株能分泌抗蓝藻（Cyanobacteria）的活性物质。其中一株被鉴定为弧菌（Vibrio）。为进一步验证其产生的活性物质，将其在海洋肉汤培养基中培养。试验结果表明：该弧菌（Vibrio）产生的活性物质为β-氰基-L-丙氨酸（L-CNAIa），对细菌和真菌的生长没有影响，但一定浓度的该物质会影响某些蓝藻（Cyanobacteria）的生长。化合物β-氰基-L-丙氨酸（L-CNAIa）可能是影响海洋藻类种群动力学的一个重要因素。

2.2 多肽

Imamura[5]从Biwa湖含微囊藻的水样中分离出一株鞘氨醇单胞菌（Sporobolomyces），该鞘氨醇单胞菌（Sporobolomyces）释放的溶藻物质对微囊藻（Microcystis）有强烈杀灭作用。经鉴定，该溶藻物质为五肽argimicinA，分子式为 C32H6N12O8。它在12ug/mL和100ug/mL浓度时分别对绿色微囊藻（Microcystis stiviridsi）和铜绿微囊藻（Microcystis areuginosa）有很强的溶藻活性，对直接从水体中分离的含有细菌的蓝藻（Cyanobacteria）亦有很强的溶藻效果。Banin[6]报道了一株珊瑚褪色弧菌（Vibrio shiloi），该菌能合成并分泌一种胞外多肽，被称为毒素P，该毒素能够抑制与珊瑚共生的虫黄藻的光合作用，导致虫黄藻死亡。

2.3 蛋白质

Lee[7]从海水中分离一株编号为A28的假交替单胞菌（Pesudoaletormonas）。试验结果表明：该菌能杀灭骨条藻（Skeletonema costatum）。将A28培养一段时间后，取其上清液作溶藻实验，发现该上清液有很强的杀藻能力。上清液经过高温处理，结果A28的上清液没有表现出杀藻活性。进一步试验检测表明A28能产生一种胞外丝氨酸蛋白酶杀藻。

Mitsutani[8]报道一株编号为A25的假交替单胞菌（Pesudoaletormonas），用一定浓度的该菌液接种到骨条藻（Skeletonema costatum）培养物中后，2天内就能把骨条藻（Skeletonema costatum）全部溶解。双向电泳对A25蛋白进行分析，结果表明：A25在菌体生长稳定期能产生大量蛋白质，而在稳定期以后的各时期未检测到活性物质。把稳定期菌体进行离心，仍然表现出溶藻能力。这些试验结果表明：A25是通过稳定期分泌的蛋白质活性物质来溶解骨条藻（Skeletonema costatum）的。

2.4 抗生素

Dakhama[9]发现一株铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），该菌能释放低分子量并具有热抗性的物质。在试验的藻类中，该菌能强烈抑制蓝藻（Cyanobacteria）和绿藻（Chlorophyta）的生长。进一步检测结果表明：这株铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是通过释放琼脂扩散性嗪色素抑制宿主藻类的生长。

2.5 羟胺

Paul[10]分离出一株节杆菌（Arthorbacetsrp），属于硝化细菌。试验结果表明：该菌的分泌物能强烈抑制小球藻（Chlorella vulgaris）的生长。进一步试验表明：该菌是通过氧化铵或其它还原性的氮化合物释放的羟胺抑制小球藻（Chlorella vulgaris）的生长。

2.6 其它溶藻细菌的活性物质

近年来，随着对溶藻细菌研究的不断深入，溶藻细菌的溶藻活性物质不断被报道。多数学者报道的都是溶藻细菌通过分泌胞外物质对宿主藻细胞起到抑制或杀灭的作用。Lovejoy[11]发现一株假交替单胞菌（Pesudoaletormonas）分泌细胞外物质溶藻。Baker[12]发现某种假单胞菌（Pseudomonas）能够分泌活性物质杀灭硅藻（Thalassiosira pseudonana），这种物质分子量大且对热不稳定。裴海燕等[13]分离出一株芽抱杆菌（Bacillus），该菌通过释放溶藻物质溶藻。该溶藻物质耐热性较好。目前，多数溶藻细菌的活性物质没有被鉴定，所以它们的作用机制也不是很清楚。

3 溶藻细菌溶藻活性物质的提取和筛选方法

通常情况下，溶藻细菌活性物质的提取是通过检测培养菌上清液是否具有溶藻活性的方法进行的。即首先通过常规平板法分离筛选细菌，然后用被筛选溶藻细菌培养物上清液进行溶藻试验，若该上清液有溶藻能力，这就表明该细菌是通过分泌活性物质进行溶藻的。最后再通过理化方法以及分子生物学手段对活性物质进一步鉴定，进而对活性物质作分类，但是这种方法效率比较低。Yoshikawa[4]为了检验其所分离细菌的分泌物是否具有溶藻活性，从供试的2594株分离细菌中仅发现37种能产生抗颤藻（Oscillatoria）的物质。这种方法属于随机筛选，不仅劳动量大，且试验周期也较长。为了提高筛选效率，Imamura[2]采用了一种两步筛选法来筛选抗微囊藻（Microcystis）化合物的效率。首先将通过藻菌液体共同培养筛选出溶藻细菌，然后用无水乙醇提取溶藻细菌的培养物，待培养物室温干燥后，将其与微囊藻（Microcystis）共培养，从中筛选分泌杀微囊藻（Microcystis）物质的菌株，最后从这些菌株中分离和鉴定杀藻物质。这种方法在很大程度上提高了细菌杀藻物质的筛选效率。

因细菌溶藻活性物质种类较多，特性也有差异，虽然现在也逐步采用分子生物学手段，但仍然有多数溶藻活性物质未被纯化和鉴定，这就限制了对其溶藻机理的进一步研究。鉴于此，这就需要人们掌握一定的先进方法和技术手段。

4 溶藻细菌溶藻活性物质的研究展望

溶藻细菌的溶藻活性物质作为开发新型生物杀藻剂的一种新思路，具有重要的理论意义和潜在的应用价值。因此，如何提取、纯化和鉴定高效并具有特异性的溶藻活性物质是目前研究的重点。而如何提高溶藻细菌的筛选效率和对溶藻活性物质分子生物学方面的研究将是未来一段时间内要研究的热点。而采用基因工程手段来构建新型菌株将是溶藻细菌研究领域中最具意义的研究课题。

［1］周云龙，于明.水华的发生、危害和防治［J］.生物学通报,2004,39(6):11～14.

［2］边归国.去除淡水浮游藻类方法的研究进展［J］.四川环境,2004,23(6)：67～68.

［3］吴刚，席宇，赵以军.溶藻细菌研究的最新进展［J］.环境科学研究，2002，15(5)：43～46.

［4］YOSHIKAWA K,ADACHA,NISHIJIMA M,et al.Beta-Cyanoalanine production by marinebacteria on cyanide free medium and its specific inhibitory activity toward cyanobacteria［J］.Appl Environ Microbiol,2000,66:718～722.

［5］IMAMULA N,MOTOIKEI,SHIMADA N,et al.An efficient screening approrch for anti-microcystis compounds based on knowledge of aquatic microbial ecosystem［J］.Antibiotics,2001,54(6):582～587.

［6］BANIN E,T.ISRAELY A,KUSHMARO Y,et al.Rosenberg of the coral-bleaching bacterium Vibrio shiloi into Oculina patagonica［J］.Appl Environ Microbiol,2000,66(7):3031～3036.

［7］LEE S,KATOJ,TAKIGUCHIN,et al.Involvement of an extracellular protease in algicidal activity of the marine bacterium Pseudoalteromonas sp.StrainA28［J］.Appl Environ Microbiol,2000,66(1):4334～4339.

［8］MITSUTANIA,K TAKESUE,MKIRITA,et al.Lysis of Skeletonema Costatum by Cytophaga sp.,isolated from the coastal water of the Ariakesea［J］.Nippon Suisan Gakk,1992,58(2):2158～2167.

［9］Dakhamaa.Isolation and identification of antialgal substaneesprodueed by Pseudomonasaeru-ginosa［J］.JAPPI.Phyeol1993,5(9):297～306.

［10］PAUL SB,JINNQUER,HAIMBG.Bacterial suppression of Chlorella byhydroxylamineproduction［J］.Water Rsearch1979,13(1):267`273.

［11］LOVEJOY C,BOWMANJP,HALLEGRAEFFG.M.Algidical effects of a novel marine Pseudoalteromonas isolate(class Pro-teobacteria,gramma subdivision)on harmful algal bloom species of the genera Chattonella，Gymnodinum and Heterosigma［J］.Appl Environ Microbiol,1998,64(8):2806～2813.

［12］BAKER K H,HERSON D S.Interactions between the diatom Thallasiosira Pseudonana and an associated Pseudomonad in amariculturesystem［J」.Appl Environ Microbiol,1978,35(6):791～796.

［13］裴海燕，胡文容，曲音波,等.一株溶藻细菌的分离鉴定及其溶藻特性研究［J］.环境科学学报，2005，25(6):796～80.