HBV准种与耐药相关性进展

池肇春

准种（quasispecies）是指同种遗传差异性的概念，在乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染者体内，常形成以一个优势株为主的相关突变株病毒群称为HBV准种，它是由一种母序列和来自该系列的大量相关突变体所组成的病毒基因组。HBV病毒种群间基因序列的差异，一般不超过核苷酸总长度的2%～5%。因此，HBV准种是指由遗传学上高度相关，个体之间又有微小差别的HBV种群，在自身和外界因素的影响下优势和劣势种群的构成又处于不断变化之中。近几年来在慢乙肝抗病毒治疗的患者中发现存在准种基因变异。且越来越多的研究证实，HBV准种的产生与抗病毒治疗的耐药相关。影响抗病毒疗效因素很多，包括人体免疫状况、病毒准种、基因变异，在难治性病例中准种可能占重要因素。

一、抗病毒治疗患者肝内外HBV的分子特征

核苷类似物特异性地结合于HBV聚合酶的底物结合部位，影响病毒复制。如果HBV聚合酶区基因突变，将导致某些特定部位的氨基酸被置换，使之与药物的结合力下降，从而引起药物敏感性降低和耐药。目前已知常见的耐药突变位点主要见于逆转录酶（RT）的A，B，C，D区。

在HBV复制途径一个有错误倾向的逆转录酶，潜在产生药物耐药准种。长期接受抗病毒治疗的患者，在肝细胞、周围血单核细胞（PBMC）HBV变异的程度尚不明了。当药物耐药和分子变异时患者血浆中有可能不能检出HBV DNA。有报告从9例接受肝移植的乙肝患者，用敏感的PCR/核酸分子杂交方法评价NBV基因组，肝和PBMC有HBV DNA者检测CCCDNA。结果HBV DNA血浆检出率为43%（3/7），肝100%（9/9），PBMC 83%（5/6） 检出 HBV DNA，HBV CCCDNAD在全部9例肝中检出，PBMC有1例检出。4例患者临床诊断耐药。HBV P基因 系列显示，野生型HBV在血浆100%（2/2），PBMC 83%（5/6），但肝仅 33%（3/9） 检出 HBV P，而且 66%对拉米夫定（LAM）和（或）阿德福韦酯（ADV）耐药。转S基因不影响HBV抗原性。从肝有抗病毒耐药突变显示，患者之间的准种差异甚大，尽管表现HBV抑制，但在肝却持续证实存在HBV复制，且可能检出肝外HBV。最后认为药物耐药与肝内病毒准种有关[1]。

有人研究LAM、ETV（恩替卡韦）序贯病毒治疗HBV准种群体的演变及其临床意义。刘霖等[2]对2例采用LAM-ETV序贯的治疗出现不同临床结果的患者进行了近4年的随访，用多聚酶链反应-克隆-测序的方法研究HBV准种组成的长期动态演变，用最大似然法建立遗传进化树分析代表序列的遗传进化关系，结合血清学和病毒学指标分析HBV准种演变与临床过程的关系。结果2例患者出现了LAM耐药病毒学反弹，采用ETV治疗后，1例患者获得持续病毒学反应，另1例患者用ETV治疗72周后又出现病毒学反弹。病毒学反弹均发生在原有对药物敏感的优势准种被耐药株替代时。ETV耐药与rtL180M＋S202G＋M204VDGDG三联突变株成为优势准种密切相关。结论认为，HBV准种组成与核苷类药物敏感性密切相关。LAM耐药株可进一步演变为ETV耐药株，因此，对使用核苷类药物治疗的患者进行HBV准种监测具有重要临床意义。由于长期用核苷类或核苷类似物抗HBV治疗，往往出现一种或多种药物耐药，为了提高抗病毒治疗效果，因此了解病毒准种特异突变菌株的发生机制也是一个重要的问题，特殊的病毒株在特殊的环境内可产生HBV准种[3]。

新近国内用实时荧光PCR（RT-PCR）定量，来评估ADV耐药时的HBV准种。此方法对ADV耐药的HBV准种的敏感性和特异性100%。在32例临床患者中20例检出rtA181T和 rtN236T突变，20例中有 8例为双倍体rtA181T和rtN236T 突变[4]。

二、慢性HBV感染HBV准种的分子特征和功能分析

HBV自然地发生突变在HBV相关疾病的发病机理上可能发挥作用。有人研究慢性HBV患者全长HBV准种的分子特征和功能分析。Cui[5]等测定自然发生的和1例慢性乙肝患者进行全长HBV准种的功能分析。10个HBV克隆分离标本的基因型 均为B4基因型和亚型adw。多数克隆标本，氨基酸取代和核苷酸改变发生在核心蛋白、X蛋白和核心启动子的特定部位。在核心蛋白10个克隆标本有8个是cl3L，cL60M，和cl97L。10个克隆标本全部检出cP130T。在X蛋白5个克隆标本检出xl127M，在基底核心启动子仅在1个克隆标本发现A1762T/G1764A突变，2个克隆标本在核苷1772和1773之间插入11-bp（碱基对）。6个克隆标本在复制能力水平上竞争复制出现变异。结论指出，准种HBV病毒基因变异显示有不同的突变类型。

在慢性感染HBV的个体，HBV准种的高度差异可增加HBV基因的变异，赞成对核苷/核苷酸类似物（NUCs）耐药于治疗前已存在的观点。Pollicino等[6]在不治疗的HBsAg携带者与LAM耐药患者就HBV逆转录结构域和重迭S基因进行比较。从100例不治疗和59例LAM耐药患者分离完整的HBV，了解它们逆转录结构域和重迭S基因情况。结果不治疗组未检出原发性突变对核苷/核苷酸类似物耐药，但有46例（46%）变异联合继发的或伴发的突变，4例患者突变修饰S蛋白抗原性。在LAM耐药组，除了原发LAM耐药突变外，检出69.5%（41/59）有原发和继发联合突变，其重要性在于LAM引起RT（逆转录酶）突变，2例患者停止编码重迭S基因和修饰S蛋白抗原性。另9例患者停止修饰S蛋白抗原性。结论指出，HBV突变伴有对NUCs耐药，在大多数感染未治疗的患者可能已经存在对NUCs耐药，在LAM治疗期间发生基因变异也可能带来基因突变，支持对其他NUCs耐药和（或）潜在S蛋白免疫反应性改变。

一个3年的前瞻性研究HBV单一感染和HIV-HBV联合感染患者，分析HBV在核心底部启动子（BPC）和核心前基因（precore，Pc）部位有基因不均一性。39例HBV感染患者，20例为HBV单一感染，19例与HIV联合感染，分离HBV 82份标本，研究BPC/Pc基因部位准种水平。结果HBV单一感染和与HIV联合感染患者中HBV主要为A2基因型。BCP突变单一感染患者比联合感染者多见（P＜0.0001），Pc突变主要来自e抗原阴性的HBV单一感染患者。HBV与HIV联合感染时HBV的特征，在BPC调节部位倾向于野生型的基因类型较多，Pc部位突变取决于基因型，但与HIV联合存在无关[9]。隐匿性HBV（O-HBV）感染在血清的特征是存在HBV DNA和HBsAg阴性，虽然HBV/HIV联合感染时O-HBV较多见，但有关HBV突变这一方面的分析研究不多。Martin等[7]报告33例HIV阳性血清标本、27例慢性HBV（C-HBV）和6例O-HBV感染者的血清标本，显示前S、S扩增。由于O-HBV S基因、前S基因突变，改变了抗原分泌和（或）减少复制而导致HBsAg不能检出[8]。

三、HBV准种与药物反应和耐药的相关性

研究表明，核苷类似物的不同反应性与HBV存在准种现象有着密切的关系。如果我们能够检测患者血清中HBV准种特点，又能清楚了解到不同准种的HBV对不同药物敏感性的差别，就有可能优化抗病毒治疗的药物的选择和方案的制定，从而提高抗病毒治疗的效果。

根据HBV DNA序列的不同，将HBV分成不同的基因型。由于HBV基因的多样性表现为8个基因型（A-H）。HBV的自然经过和对治疗的反应可受HBV基因型的影响。HBV含有4个开放阅读框架，即前S/S基因、前核心/核心基因、聚合酶基因和X基因。当HBV缺乏校阅能力时周转率很高，结果大量准种自然产生。前S基因突变时，即使有 HBV复制也可不能检出HBsAg，S基因突变引起抗HBs结合亲和力降低，前核心突变时消除HBeAg，而基部核心启动子突变产生HBeAg基因下调。基部核心启动子突变伴有HBV复制增加和进展性肝病发生，如肝硬化、肝细胞癌发生率高。聚合酶基因突变常由抗病毒治疗失败引起。若抗病毒治疗前已存在突变则限制了抗病毒药物的进一步选择[9，10]。因此，了解HBV变异和突变在诊断和处理HBV感染上至关重要。目前研究证实LAM耐药主要是由rtM204V/I/S原发耐药突变以及rtL180M、rtV173L等继发补偿突变所致。替比夫定（dT）耐药突变与LAM相似。ADV耐药主要与rtN36T或vtA181V原发耐药突变相关。ETV耐药突变包括rtM204和rtL180突变位点以及rtT184、rtS202G或rtM250其中一个ETV原发耐药突变位点。

研究认为，耐药突变的氨基酸替换形式可影响病毒的耐药性与复制能力。如上所述，不同的核苷类似物产生的耐药突变位点不一样，因此开展病毒种群大规模测序，不但可以找到已知突变位点，同时也可发现新的突变位点，加深对病毒耐药形成机制的认识。

HBV感染是一动力过程，由于药物耐药突变，持续抗病毒治疗可引起突变缺失。收集LAM治疗失败，后来改用阿德福韦酯（ADV）患者HBV DNA是顺序在两个不同的区域，一个是逆转录1kb区域，另一个是在C基因和部分前S基因在1.5kb区域，RT（逆转录酶）区域的序列分析指出，改用ADV后LAM耐药突变减少，最终突变不能检出。研究发现，两种抗病毒治疗之间在C和前S区域准种分布和缺失类型也是不同，LAM治疗标本野生型株57.7%是在结构域，缺失在前S区域。持续治疗可影响到ADV，病毒群在C基因占优势包含86%为81和96bp缺失，两者较多的缺失包含T和B细胞抗原决定部位。由于C基因抗原决定部位缺失伴有LAM耐药突变的逐渐消失，可持续对存活的HBV进行抗病毒治疗[11]。Margeridon-Thermet等[14]对HBV准种用焦磷酸测序（UDPS）来了解核苷/核苷类似物耐药突变，G到A高突变由脱辅基脂蛋白B信使核糖核酸编辑酶介导，由于NRTI（核苷/核苷类似物逆转录酶抑制剂）耐药突变，用UDPS可检出流行率低的HBV变异。

在临床上有些耐药病例并没有检测到已知耐药相关突变，但临床仍表现耐药，除宿主因素外，可能与基线时准种的组成有关。多数研究者认为，病毒准种异质性越大，组成准种的病毒株越复杂，其适应环境变化的能力就越强，抗病毒治疗的难度也就越大。此外，NAs耐药补偿突变位点、不同基因型、混合感染等均与抗病毒反应有关，有待今后作更深入的研究。

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