树突状细胞与慢性乙型肝炎*

赖小欢 综述 潘兴南 审校

树突状细胞（dendritic cell，DC）是由Steinman和Cohn于1973年发现的[1]，是一类具有最强抗原提呈功能的专职抗原提呈细胞（antigen-presenting cell，APC），膜表面高表达组织相容性复合物（major histocompatibility complex，MHC）-Ⅰ/Ⅱ类分子，能将抗原信息提呈给T细胞，具有强大活化T细胞的功能。此外，还具有调节免疫和诱导免疫耐受的作用。本文就DC与慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）的基础和临床的关系及研究现状作一综述。

一、DC来源、分类及功能

DC广泛分布于除脑以外的全身各脏器，数量极微，仅占外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）的1%以下，占小鼠脾脏0.2%～0.5%。体内的DC以皮肤DC为主，是机体天然免疫屏障的之一。DC起源于多能造血干细胞，可由骨髓样干细胞和淋巴样干细胞分化而来。骨髓来源的未成熟DC（主要为CD34+DC前体细胞）具有强大的摄取、加工和处理抗原的能力，主要通过吞饮作用、吞噬作用及受体介导三种途径实现。激活后的DC表面受体CCR5等表达逐渐减少，CXR4、CCR7的表达渐增高。成熟后的DC增殖和吞噬抗原能力下降，其膜上高表达MHCⅠ、Ⅱ类分子，协同剌激因子 CD80、CD86，黏附分子 CD40、CD44、CD54，整合素β1、β2及特征性标志CD83。DC一旦摄取抗原，加工并提呈至细胞表面后就丧失了加工新抗原肽段的能力，抗原提呈功能逐渐增强，其表面表达免疫共刺激分子、产生IL-1等细胞因子并且对T细胞的刺激能力增强。DC从发育至成熟需要10天左右，体内寿命仅3～4周。DC可分为DC1和DC2两大类[2]，DC1特异性表达表达CD11c+，主要起抗原捕获和呈递作用，可分泌IL-2诱导Th0细胞向Th1细胞分化；DC2特异性表达CD123+（CD11c-），分泌IL-4促使Th0细胞向Th2细胞分化，与介导体液免疫有关。Amsen等[3]的研究发现DC表面的凹槽可决定Th0向Th1或Th2的分化。应答晚期，Th2细胞通过分泌高水平IL-4来反馈性诱导DC2，从而间接促进DC1成熟；同样，IFN-α能抵抗IL-4的效应、促进DC2分化。另外，CD40L激活的DC2也可促进CD8＋调节细胞的活化，提示DC2在免疫耐受方面有着重要作用。除上述功能外，DC在遭遇病原体时还可早期合成IL-6、TGF-β来促进Th17细胞的分化，或分泌IL-10与TGF-β来诱导Treg的产生[4]。

二、肝脏中的DC

肝脏中的DC来源于骨髓，主要位于中央静脉和门脉区[5]，约占总DC的10%[6]。肝内DC可分为髓样DC和淋巴样DC两类[7]，这两类细胞以交叉表达CD8和CD11b为特征，前者为CD8-CD11b+，后者特异性表达CD8+CD11b-。2003年Lian ZX[8]在干肝脏NK1.1-CD11c+DC中发现四种DC亚群，分别是B220+CD4+，B220+CD4-，B220-CD11b+ 和 B220-CD11b，其中B220+DC可以产生IFN-α，它们按细胞表面CD40、CD80、CD86、MHC-II、CD11c的表达程度分为成熟和不成熟 DC[9]。Venu G[10]在研究小鼠肝脏和脾脏CD11c+DC时发现，肝脏DC多为不成熟DC，其捕获抗原能力及刺激T淋巴细胞反应的能力均较脾脏DC弱，尽管它们能产生炎症因子并刺激活化T细胞，但免疫激活能力远不及其他淋巴器官组织中的DC。但是，另一方面，肝脏作为消化系统的一部分持续暴露于高细菌磷酸脂多糖（LPS）的环境下，LPS作为DC的成熟诱导剂，可促进DC协同信号分子及MHC-II的表达上调，同时分泌IL-12等细胞因子，增强DC诱导抗原特异性T淋巴细胞活化和增殖的能力。肝脏内DC极少的含量及分离培养困难限制了人们对肝内DC了解，目前关于肝脏DC的形态学和功能学的研究均来源于对肝脏非实质细胞的间接体外培养所获得的数据，对于肝内DC在肝脏疾病发生、发展及转归中的作用有待进一步研究。

三、DC在对抗HBV感染中的作用

人感染乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV）后的转归依赖于病毒因素和免疫系统两个方面。在CHB患者体内主要表现为CD8+T细胞对病毒抗原的耐受和CD4+T细胞功能的缺陷。DC在HBV感染者体内的天然免疫和适应性免疫中均发挥着重要的作用。DC在早期感染中的作用也非常关键[11]，初期的几分钟到几小时，天然免疫重要组成因素的NK、NKT细胞即可产生IFN-γ杀死感染HBV的肝细胞，IFN－γ和活化的NK细胞可促使DC成熟并启动抗原特异性的细胞免疫和体液免疫反应[12]。其中，Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）是天然免疫与适应免疫的桥梁，DC成熟与TLR密切相关，TLR受相应的病原相关分子模式（PAMP）触发后经信号转导通路激活NF-κb，引起巨噬细胞和DC分泌IL-1、IL-12、IL-8、TNF-α、IFN-γ等细胞因子[13]。在适应性免疫中，DC作为抗HBV免疫识别的“前哨”在提呈HBV抗原后，将其处理成不同长度的多肽，其中Ⅰ类多肽与MHC-Ⅰ类分子结合被呈递给CD8+T细胞，Ⅱ类多肽与MHC-II结合形成MHC-Ⅱ/Ⅱ类多肽复合物提呈给CD4+T细胞[14]。其中特异性细胞毒性CD8＋T细胞（CTL）是清除肝细胞内HBV的主导力量，可释放IFN-γ、TNF-α等细胞因子抑制或清除肝细胞内的HBV，还可以通过特异性细胞毒作用直接杀伤靶细胞，其活性可被CD4+T细胞调节[15]。

近年研究认为，DC与CHB的免疫耐受有关。Zhang[16]等研究发现HBV感染患儿免疫耐受期与免疫激活期患儿外周血DC亚群数量较健康儿童显著降低。OP DEN BROUW ML等[17]也发现HBsAg的存在会使耐受性DC表型产生增加。

四、HBV对DC的影响

研究发现，CHB患者体内DC数量和功能的缺陷可能是长期处于带毒状态的机制之一。研究表明，HBV及其抗原可造成DC数量、表型和功能的异常，主要表现为：①HBV直接感染DC，Arima等[18]用原位杂交 PCR 和 RT-PCR法检测慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞时发现20%～40%的DC含HBV DNA，说明在CHB患者体内DC是HBV的肝外宿主，而DC中HBV RNA的定位则表明DC可能也是HBV相关蛋白质合成的场所；②研究发现[19]，HBV感染可阻止非成熟DC转化为成熟DC，抑制成熟DC表面的CD4、CD80、CD86表达，HBsAg损伤也可能是造成HBV免疫逃避的一个重要因素之一[20]，而Andrea M[21]的研究证实，CPG修饰的HBV片段可以减轻浆细胞样DC（plasmacytoid DC，pDC）的功能损伤；③抑制成熟DC生成IL-12，而生成NO水平升高[22]；④抑制DCs对HBV特异性T细胞的活化[23]；⑤HBV高载量可以直接导致HBV特异性CTL的免疫耐受或丢失，还可以引起DC发生功能性损伤，从而导致DC对特异性CTL的激活作用下降，引起特异性CTL呈免疫耐受状态；⑥另外，在对CMV和HIV的研究发现，病毒可在DC内被分离，并破坏DC的功能以达到逃避免疫监视的目的，而DC的移行能力和增殖淋巴组织中T细胞的能力使得它们将感染传播到淋巴器官中的T细胞。

五、DC与CHB的治疗

目前国内用于治疗CHB的抗病毒药物主要有干扰素和核苷（酸）类似物两大类，它们与DC的关系研究如下：

（一）干扰素 干扰素是目前治疗慢性乙型肝炎的主要药物之一，具有抗病毒和免疫调节作用，可抑制病毒DNA复制，抑制病毒蛋白的合成和转运及病毒颗粒的成熟和分泌，能促进人类白细胞抗原I、II类分子的表达及增强CTL、APC和NK细胞等的活性，其治疗CHB的有效率达40%。有研究表明[24]，利用IFN-α诱导的单核细胞产生的树突状细胞具有增强CD8＋细胞抗肿瘤细胞的免疫作用，提示IFN-α可能具有诱导树突状细胞的作用，并通过树突状细胞途径发挥其免疫调节作用。同样，国内外研究还发现mDC的成熟也有赖于IFN-α的介导[25]，而IFN-α可反馈性的抑制pDC的产生[26]。另外，朱传武[27]对不同干扰素抗病毒应答的CHB患者的外周血DC研究发现，干扰素的应答与患者DC的基础状态有关，成熟的DC或功能的完善有利于促进干扰素的抗病毒疗效。

（二）拉米夫定（LAM） LAM是胞嘧啶核苷类似物，是最早被国内外批准的治疗CHB的药物。Boni等[28]研究发现LAM治疗有效的患者，其辅助性T细胞和细胞毒性T细胞的功能可得到不同程度的恢复；李捍卫等[29]对16例拉米夫定抗病毒治疗的CHB患者动态观察48周发现，随着HBV被长时间有效的抑制，DC表面共刺激分子CD80、CD40有所恢复，同时研究还发现，YMDD变异组的DC表面HLA-DR持续降低。

（三）阿德福韦酯（ADV） ADV是腺嘌呤磷酸酯类化合物。有作者研究发现[30]，ADV治疗后的CHB患者循环调节性T细胞减少，病毒特异性CD4+T细胞活性提高，髓样DC的数量增对且功能增强，提示ADV在HBV免疫应答和免疫耐受中发挥重要作用。

（四）替比夫定（LDT） LDT是天然胸腺嘧啶脱氧核苷的自然L型对应体，通过与HBV天然底物胸腺嘧啶的5’-腺苷竞争，从而抑制HBV DNA多聚酶的活性，是一个强大的特异性HBV抑制剂，具有较高效的HBeAg转换率。大量研究表明LDT可改善CHB患者的细胞免疫功能，但他能否直接或间接作用于树突状细胞，仍有待于进一步研究。

（五）恩替卡韦（ETV） ETV为环戊基鸟嘌呤核苷类似物，是当前较好的核苷类似物。卢高峰[31]在研究ETV对CHB患者DC的体外影响时发现，经ETV处理的CHB患者外周血DC数量、功能基表型的表达均较未处理组高，提示ETV在DC的成熟、增殖中起到一定作用。

六、DC在CHB治疗中的应用

慢性HBV感染者的DC与T细胞相互作用缺陷导致特异性 T细胞免疫缺陷，故恢复DC功能的免疫治疗成为治疗HBV持续感染的热点，而针对DC抗原提呈功能的恢复，目前的研究主要集中在细胞因子作用[32]、HBsAg疫苗体内刺激[33]、DC疫苗回输[34～36]及DNA疫苗[37]的应用上。其中HBsAg致敏的DC是慢性乙型肝炎最具潜能的治疗性疫苗，这种DC是用于抗病毒的免疫治疗，主要通过体外病毒抗原致敏DC，再将其回输至患者体内，诱导出病毒特异性的CTL杀伤感染细胞，目前公认的体外刺激因子有GM-CSF、IL-4、TNF-α，另外LPS、IL-12也能促进DC分化[38]。

七、小结

DC在CHB中的重要作用决定着其在治疗中的关键地位。近年，已逐渐将免疫治疗作为CHB治疗的重点方向之一，将DC作为免疫佐剂用于CHB的临床治疗已陆续报道，其发挥抗病毒及抗肿瘤的机制主要是负载HBV特异性抗原后能够迁移至T淋巴细胞富集的二级淋巴器官，从而激活特异性免疫反应[39]。但DC在体内的含量少、来源困难、分离培养耗时长、费用高及培养过程中和抗原或DNA负载的低效性等均限制着该项技术的发展，但我们有理由相信随着DC研究的深入，体外获得大量的DC和制备DC的疫苗的技术日趋成熟，特别是可以针对每个患者制备特异DC疫苗，从而进行特定的免疫治疗，会成为其他治疗不可代替的优势。

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