动物遗传育种研究进展

段 芳,兰志刚,李卫娟

(1.昆明学院 农学院，云南 昆明 650214；2.云南省畜牧兽医科学院，云南 昆明 650224)

随着遗传学理论的不断发展，动物遗传育种技术经历了表型和表型值选种技术育种、DNA重组技术育种、分子技术育种3个阶段。其中，在20世纪80年代国际上动物育种已进入分子水平，朝着快速改变动物基因型的方向发展，即开始分子育种技术阶段。国内也紧跟国际步伐，主要研究畜禽遗传育种的分子生物学基础, 为我国21世纪畜牧业的发展提供理论基础和先进技术。现在，动物分子育种仍占据着动物育种大部分的领地，并将主导21世纪动物遗传育种的发展趋势。本文就动物遗传育种的过程、理论基础、国内研究现状以及发展趋势进行综述。

1 表型和表型值选种技术育种

这一阶段是1900～1960年，即从孟德尔论文的重新发现到法康纳的《数量遗传学概论》第1版问世[1]。1856～1865年孟德尔在豌豆杂交试验中发现了遗传学的分离和自由组合定律，并在布隆博物学会刊发表了题为“植物杂交试验”的论文，但这一重大发现实际上并未引起科学界的关注，直到1900年由荷兰阿姆斯特丹大学教授狄·弗里斯、德国土宾根大学教授科伦斯和奥地利维也纳农业大学讲师冯·切尔迈克几乎同时发现并证实了孟德尔遗传规律，从而引起了科学界的广泛重视，也标志着经典遗传学的开始。在1909年瑞典遗传学家H.尼尔松-埃勒提出多基因假说，用每对微效基因的孟德尔式分离来解释数量性状的遗传。1910年摩尔根和他的3位杰出学生用果蝇进行了大量实验发现了经典遗传学的第3个基本规律——遗传连锁规律；1918年Fisher发表了“根据孟德尔遗传假设的亲属间相关研究”，预示着数量遗传学的诞生。数量遗传学是孟德尔遗传学的进一步发展，孟德尔遗传学的许多原理都适用于它，不同之处在于孟德尔遗传学中的性状主要决定于主要基因，即它们是由能分别辨认其效果的一对、两对或三对基因的分离、自由组合和连锁所造成的，而数量遗传学所研究的性状则是由效果极其微小，因而不能分别辨认的多基因所造成的。1953年沃森和克里克发现的DNA双螺旋结构标志着遗传学从此迈进了分子遗传学的新时代[2]。在多基因假说中提到的数量性状表型值就是一个性状能够直接度量或观察的数值，任何一个数量性状的表现都是遗传和环境共同作用的结果，即性状的表型值可分为由遗传和环境因素造成两部分；而育种值选种既不包括不遗传的环境效应, 也不包含可以遗传但不易固定的显性和上位效应, 它反映的是可以遗传且能够被固定的基因加性效应部分。因此，随着育种学的发展表型和表型值选种必须向动物育种的第二阶段发展，即育种值育种。

2 计算机和DNA重组技术育种

动物育种的第2阶段是1961～1986年，这个阶段是分子遗传学飞速发展的时期[1]。1961年Francois Jacob 和Sydney Brenner阐明了基因指导蛋白质合成的分子过程；1966年Marshal l WN和Ha r GK破译了全部的三联体“遗传密码”，为现在的分子遗传学奠定了基础；1970年HTemin和DBal t imore发现了在一些RNA病毒中依赖RNA的DNA复制酶，即逆转录酶；1971年DNathans和HOSmith发现了能够在特定位点切割DNA的限制性内切核酸酶；1972年Paul Berg首次在体外试验了DNA重组；1973年Herb Boyer和Stanley Cohen利用质粒克隆了外源DNA；1977年Wal ter Gilber t和Frederick Sanger发明了测定DNA序列的方法，1985年Kar ry Mul l is发明了聚合酶链式反应技术[2]。这一系列的发现和发明为DNA重组技术的出现奠定了基础。DNA重组技术改变了常规杂交的基因导入方法, 可以使所需要的目的基因被转入而不带有其它不需要的基因, 从而使快速育种成为可能。在DNA重组技术发展的同时，微型计算机技术也在快速发展，计算机的应用使动物主要经济性状的育种从表型值选择进入育种值选择, 大大提高了选种的准确性。

3 分子技术育种

分子育种是动物育种的第3个阶段，是依据分子遗传学和分子数量遗传学的理论，利用DNA重组改良畜禽品种的一种技术。动物分子育种分为转基因育种和基因组育种。转基因育种是通过基因转移技术将外源性基因导入到动物基因组上，从而达到改良重要生产性状(如生长率、遗传抗性等)或非常规性育种性状(如生产人类药用蛋白、工业用酶等)的目标。基因组育种是通过DNA标记技术来对某些重要生产性状基因座位直接进行选择改良, 也可以同时考虑到多个生产性状座位, 甚至是动物个体的整个基因组，因此也可称为基因组扫描选择。

3.1 转基因育种

动物转基因技术是将外源基因整合到动物受体体细胞基因组上，并在受体动物体内稳定表达出相应的生物学表型的一种技术，其包括转基因重组子构建技术、重组子导入动物体内的转化技术、转基因在受体动物染色体上稳定整合及可控性表达技术等。转基因动物的产生标志着人们可成功应用转基因技术，避开物种间杂交不育的生殖隔离，进行基因交流，打破物种界限，突破亲缘关系的限制，培育出自然界和常规育种难以产生的具特别优良性状的动物品种；可以改变常规育种需要进行多代杂交，所需时间长的缺点，从而加快育种进程。

转基因动物育种可以充分利用所有可能的遗传变异，从而极大地提高畜禽遗传改良的幅度和速度，同时还可根据人们的需求创造出一些非常规的畜牧产品。因此，转基因动物技术在20世纪80年代初诞生时起，它就在改良畜禽生产性状、提高畜禽抗病力以及利用转基因畜禽生产非常规畜牧产品等方面展现了广阔的应用前景[3]。

3.1.1 转基因技术改良动物重要生产性状 猪作为优质的肉用型家畜，人们对其瘦肉率、肉质等主要经济性状方面的育种改良一直在做不懈的努力。1985年Hammer和Bem首次用显微注射技术获得转基因猪，其生长速度显著高于同窝非转基因猪，胴体脂肪明显减少，且饲料利用率提高17%[4]。1999年4月加拿大安大略省的硅湖大学基因工程研究人员利用转基因技术培育出了环保猪，是世界上第1只能解决环境保护问题的动物，其排出的粪便含磷量减少75%[5]。2006年4月美国密苏里-哥伦比亚大学的赖良学等获得了转线虫fat-1基因(ω-3去饱和酶基因)的体细胞克隆猪[6],其体内表达的外源基因可以将猪体内的ω-6系饱和脂肪酸转化为ω-3系不饱和脂肪酸,提高了ω-3系脂肪酸含量,降低ω-6/ω-3的比例，显著提高了猪肉的营养价值。湖北省农业科学院畜牧研究所与中国农业科学院兰州兽医研究所合作，将抗猪瘟病毒(HCV)的核酶基因导入猪中，获得抗猪瘟病毒的转基因猪，从而提高抗病能力[5]。

牛是奶肉均提供的优良家畜，利用转基因技术对牛进行品种改良或新品种培育主要体现在提高牛的抗病能力和提高牛的肉奶产量、改善肉奶品质。Donovan等[7]在2005年将编码溶葡球菌酶的基因转入奶牛基因组中获得转基因牛。结果表明，其乳腺中表达的溶葡球菌酶可以有效预防由葡萄球菌引起的乳腺炎，转基因牛葡萄球菌感染率仅为14%，而非转基因牛感染率达71%；2003年，Brophy等[8]研究人员在奶牛的胚胎细胞中加入β酪蛋白和κ酪蛋白，成功培育的转基因奶牛所产的奶中β酪蛋白含量提高了20%，κ酪蛋白的含量也增加了一倍。

羊是一种以产肉为主、产奶为辅的家畜，其肉和奶的营养价值均高于牛。国内外利用转基因技术培育的绵、山羊新品种重在提高羊毛产量和质量、改善奶品质、提高抗病力等不同性状。1998年，Bawden等[9]将毛角蛋白II型中间细丝基因导入绵羊基因组并使其在皮质中特异表达，结果转基因羊毛光泽亮丽，羊毛中羊毛脂的含量明显提高。2005年，澳大利亚科学家Amdas等[10]通过对成年转绵羊生长激素基因的绵羊做性能测定发现，其生长速度和羊毛产量都比对照组有显著提高；2006年，美国科学家Maga等[11]培育出在乳腺中特异表达人溶菌酶的转基因山羊，蛋白表达量达270mg/L，用奶样对猪仔的饲喂试验表明，含重组人溶菌酶的奶样能显著减少猪仔胃肠道的大肠杆菌等细菌数，并能有效抑制奶样嗜冷腐败菌和引起乳腺炎的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长，从而可用于培育抗乳腺炎的转基因羊新品种。

3.1.2 非常规性转基因育种 非常规性转基因育种是将人类药用蛋白基因或工业用酶基因导入畜禽基因组，使畜禽生产非常规性畜牧产品的技术。其将畜禽变为高效生产药用蛋白或工业用酶的化工厂，因此可称为动物生物反应器。动物生物反应器主要是研究动物乳腺反应器和动物血液反应器，其原理就是将与人体相关基因整合到动物胚胎里，使生出的转基因动物血液中，或长大后产生的乳汁中含有人类所需要的不同蛋白质。2000年12月中国农业大学成功获得了我国首例转有人α1-抗胰蛋白酶基因的转基因羊[5]。2003年，加拿大研究人员Lazaris等[12]研制出可产蛛丝蛋白的转基因山羊，这种在羊奶中生产的重组蛛丝蛋白可以“织”成高强度丝线。这种人造蜘蛛丝有蚕丝的质感、有光泽、弹性极强，因此被称为“生物钢”，在医疗、军事和建材、航天、航海等方面将有广阔的应用前景。2006年4月，韩国人Park J K等[13]通过精子显微注射猪受精卵获得了整合人重组促红细胞生成素的转基因猪，对后代泌乳母猪的乳样检测得出其氨基酸组成与商业化的重组hEPO完全相同。2002～2006年，中国农业大学李宁教授及其科研团队获得了转人乳铁蛋白克隆奶牛。牛乳中人乳铁蛋白和人α-乳清白蛋白表达量分别达到3.43 g/L和1.55 g/L，人溶菌酶在转基因牛乳中含量达1.5 g/L以上，这些重组蛋白的表达量达到了国际先进水平[5]。

3.2 基因组育种

基因组育种是分子育种在高通量测序时代的产物，即利用高通量测序技术对群体进行研究、定位到控制某个目标性状的基因，然后通过序列辅助筛选或者转基因的方法来选育新的品种。

3.2.1 分子遗传标记 同一物种的两个个体存在DNA序列差异的位点，这些位点用遗传标记就称为分子遗传标记或DNA标记。分子遗传标记是以分子遗传学和分子数量遗传学为理论，利用分子生物学技术来改良畜禽品种的一种方法。其中在动物育种上应用较广泛的分子遗传标记有限制性片段长度多态分析技术(RFLP)、线粒体DNA标记(mtDNA)、随机引物扩增多态性DNA技术(RAPD)、扩增片段长度多态性分析技术(AFLP)和单核苷酸多态性标记(SNP标记)等。

RFLP标记RFLP标记是指用限制性内切酶切割不同个体基因组DNA后, 含同源序列的酶切片段在长度上的差异。限制性片段的长度的多态性应通过DNA分子杂交来检测。S.Hiendleder等利用RFLP技术对绵羊线粒体DNA(mtDNA)进行研究，并得出世界范围内的绵羊存在野生和突变两种类型，并且存在于品种内和品种间[14]。RFLP可作为共显性的遗传标记，区分纯合和杂合基因型，其主要用于构建遗传图谱和目标基因的标记，但不足处是RFLP多态信息含量低、成本高、测定方法复杂。

m tDNA标记线粒体DNA是高等动物唯一的核外遗传物质,是一种约16.5 kb的双链双环状分子,比DNA具有更高的进化速度。造成mtDNA多态性的原因主要是碱基取代、长度变化和序列重排,因而可以用限制性酶切技术直接检测mtDNA的多态性。mtDNA在种间、种内群体间和群体内具有广泛的多态性，在分子进化和系统发育中有许多独特的优越性，作为有用的遗传标记已广泛应用在畜禽的遗传育种中。黄勇富等用24种限制性内切酶分析了1个引入品种猪、2个野猪和21个地方品种猪的mtDNA，得出我国地方猪品种的遗传多样度仅为0.007%，表明中国地方猪种遗传多样性非常贫乏，揭示了中国地方猪种可能起源于一个野猪亚种[14]。

RAPD标记RAPD标记是用9～10个核苷酸的随机序列作为引物，通过DNA聚合酶链式反应扩增基因组。RAPD技术是在1990年由Wi l l iam和Welsh等人利用PCR技术发展的检测DNA多态性的方法。RAPD标记比RFLP具有简便、快捷和多态性检出率高等特点，其主要应用于目标基因标记、遗传资源鉴定及分类。RAPD的不足处是多数位点的带型表现为显隐性共存的特点，不能区分纯、杂合子；RAPD扩增反应灵敏易受外源及污染DNA干扰。朱飞云等用RAPD分析绵羊品种间的遗传关系，得出中国美利奴A品系构成的姊妹群依次与哈萨克羊、中国美利奴多胎品系成为对应的姊妹品种[15]。

AFLP标记AFLP标记是将基因组DNA酶切后形成分子量大小不等的随机片段，再根据不同物种或不同品种的基因两端的序列设计引物用PCR进行选择性扩增。其具有DNA用量少、多态性丰富和可重复性好以及样品适应性广等特点。

SNP标记SNP是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列的多态性，包括碱基的转换、插入及缺失等形式。SNP标记是在1996年由美国学者Lander提出的第3代DNA分子标记，其具有标记密度高和遗传稳定性高的特点。目前，SNP标记主要用于基因作图、人类疾病相关基因及药物设计研究等方面。随着直接测序方法的进一步简化，低耗费以及与生物芯片技术结合程度的提高，SNP标记将成为动植物遗传育种中较为理想的分子遗传标记。

3.2.2 分子遗传标记在动物育种的应用 分子遗传标记在动物育种的应用主要有遗传标记辅助选择、数量性状主效基因的检测定位及建立基因库、动物群体遗传变异的检测、个体和亲缘关系的鉴定以及动物抗病育种等[16]。标记辅助选择可以在种内和种间进行，也可对单个或多个性状进行选择。通过分析诸如影响家畜生产性能、抗病力、抗应激反应的数量性状基因位点(QTL)与分子标记的连锁关系，确定其在染色体上的位置、单个效应及互作效应，从而通过选择可识别的分子标记来选择具有育种意义的QTL。

近年来，研究人员在经过长期选择的群体中发现了一些对数量性状有明显作用的仍然处于分离状态的单个基因，并将这些基因称为主效基因，如牛的双肌基因、绵羊的Booroola基因、猪的氟烷敏感基因等。目前，研究者正借助与主效基因相连锁的分子遗传标记手段，从群体内和家系内分离鉴别主效基因，为最终定位和转移具有重要经济价值的主基因筛选候选对象，并将主效基因由一个群体快速转移，从而达到用遗传工程的方法生产高生产性能动物品种或改良现有动物品种的目的。

由于分子标记既可以揭示编码序列的多态性，又能够揭示更多的以非编码序列形式存在的DNA多态性，所以作为群体内遗传变异的度量指标，它可以在选种和遗传资源保存工作中发挥重要作用。作为群体间的变异指标，它可以揭示物种的起源、进化过程、亲缘关系、基因组的同源性、基因在不同群体间的流动方向及速率以及物种之间的遗传距离和预测不同群体间的优势。准确分析个体间的亲缘关系对选种工作，特别是BLUP的应用具有重要作用。据分析,依配种记录进行牛群父系调查的错误率为4%～25%，而15%的错误鉴别率将使遗传进展降低9%～17%[17]。

目前，国外利用分子标记寻找抗性、易感性基因或QTL成为研究热点，并在某些方面取得了可喜的进展。许多疾病的抗性、易感性基因、QTL以及候选基因都找到了与其紧密连锁的分子标记，这样便可以通过标记辅助选择(MAS)进行动物的抗病育种。

4 展望

动物遗传育种经过表型和表型值选种；计算机技术和统计学方法的应用即数量遗传学理论研究的深入，出现了通过估计育种值方法选种；分子遗传学和生物技术的发展和应用，出现了动物的分子育种。转基因动物的研究和应用将是21世纪生物工程技术领域最活跃、最具有应用价值的项目之一，它将给人类的医药卫生、生物材料、家畜改良等领域带来革命性的变化，尤其凸显的是乳腺生物反应器生产药物带来的经济效益和社会效益。其次，随着分子生物学技术的深入和完善以及畜牧研究工作的不断进取，利用各种分子遗传标记技术将对品种资源保护和合理开发利用提供科学依据，对遗传学研究和遗传育种将起到巨大的推动作用。

[1] 吴常信，张沅，李宁.畜禽遗传育种的分子生物学基础研究——对我国农业重大基础研究项目的建议[J].中国畜牧杂志,1998,34(3):52-54.

[2] 李宁.动物遗传学.北京：中国农业出版社，2003:1-3.

[3] 刘岩，童佳，李宁，等.转基因动物育种研究的现状与趋势[J].中国医药生物技术,2009,4(5):329-334.

[4] Hammer R E,Pursel V G,Rexroad C E,et al.Production of transgenic rabbits,sheep and pigs by microinjection[J].Nature,1985,315:680-683.

[5] 童佳，李宁.转基因技术改良家畜的现状与趋势[J].中国农业科技导报，2007，9(4)：26-31.

[6] Lai L, Kang J X, Li R, et al.Genetation of cloned transgenric pigs rich in omega-3 fatty acids[J].Nat Biotechnol,2006,24(4):435-436.

[7] Donovan D M, Kerr D E, Wal l R J.Engineering disease resistant cattle[J].Transgenic Research,2005,14(5):563-567.

[8] Brophy B, Smolenski G, Wheeler T, et al.Cloned transgenic cattle produce milk with higher levels of β-casein and κ-casein[J].Nat Biotechnol,2003,21:157-162.

[9] Bawden C S, Powell B C, Walker S K, et al.Expression of a wool intermediate filament kerat in transgene in sheep fibrealters structure[J].Transgenic Res, 1998,7(4):273-287.

[10] Adams N R, Briegel J R.Multipleeffects of an additional growth hormone gene in adult sheep[J].J Anim Sci,2005,83:1868-1874.

[11] Maga E A, Cullor J S, Smith W, et al.Human lysozyme expressed in the mammary gland of t ransgenic dairy goats can inhibit the growth of bacteria that cause mastitis and the collspoilage of milk[J].Food Bome Pathogens Disease,2006,3(4):384-392.

[12] Lazaris A, Arcidiacono S, Huang Y, et al.Spider si lk fibers spun from soluble recombinant silk produced in mammal ian cell[J].Science,2002,295(5554):472-476.

[13] Park J K, Lee Y K.Recombinant human erythropoietin produced in milk of transgenic pigs[J].J Biotechnol,2006,122(3):362-371.

[14] 王晓辉，杜雄伟.分子遗传标记及其在畜禽育种中的应用[J].遗传育种，2009,248:42-43.

[15] 杨永栋，张璞，王子雄，等.分子遗传标记及其在畜牧业中的应用[J].种业研究，2006,43-44.

[16] 田万强，张道义，昝林森，等.分子遗传标记与家畜育种进展[J].中国牛业科学，2008,34(5),40-43.

[17] 戴茹娟，吴常信，李宁.DNA 标记及其在家禽遗传育种中的应用[J].中国畜牧杂志，1996,32(5):55-57.