噬菌体抗体库技术应用研究进展

蔡家利，孙加燕，扈国达，王 亮，丁 森，刘 勇

(重庆理工大学药学与生物工程学院，重庆 400054)

单克隆抗体由于高特异性和高亲和性，在疾病的预防、诊断和治疗发面发挥着重要作用，是后基因组时代重要的生物学工具［1－2］。它是一种将PCR技术和噬菌体展示技术相结合，在噬菌体表面表达、分泌，经筛选后获得特异性抗体的技术。噬菌体展示技术由Smith［3］首次阐述，基本原理是将目的基因克隆到噬菌体的外壳蛋白基因组中，转染大肠杆菌，使目的基因与外壳蛋白以融合蛋白的形式表达，呈现在噬菌体表面，通过固相亲和筛选，富集到表达目的分子的噬菌体。噬菌体抗体库技术就是该技术的一项成功应用。第1例噬菌体抗体库由Mccafferty［4］等在1990年构建。该技术的出现开创了一条简捷的基因工程抗体生产路线，并在许多领域得到广泛应用，已显示出强大的生命力。

1 噬菌体抗体库概述

1.1 噬菌体抗体库的构建

用B淋巴细胞全套抗体可变区基因克隆并组装成的噬菌体变异群体称为噬菌体抗体库［5］。抗体库构建的一般过程:① 从可变区基因来源中分离RNA。②互补DNA第1条链的合成。③构建可变区基因的PCR和可变区基因文库。④ 进行载体和可变区基因文库的限制性消化和连接。⑤感染大肠杆菌并表达目的基因。⑥筛选抗体。

1.2 噬菌体抗体库技术载体

噬菌体文库所用的载体通常是丝状噬菌体和噬菌粒［6］。丝状噬菌体载体一般所用的是外壳蛋白g3p与g8p展示系统。但也有一些学者利用其他的外壳蛋白，例如 Gao［7］等利用 g9p展示scFv，经过第1轮筛选就得到了 4.5×109个不同的scFv抗体。但是噬菌体载体通常为多价展示，容易产生螯合效应和亲和效应，导致多样化的结合效果。噬菌粒载体是一种将融合蛋白基因克隆到一个被一弱启动子调控的小质粒中的载体。噬菌粒作为载体时，需要辅助噬菌体提供野生型噬菌体蛋白，从而使噬菌粒进行正常的包装。辅助噬菌体的选择和优化对于抗体库非常重要，选择不当会影响筛选效率［8］。Mi－young Oh 等［9］用琥珀终止密码子UAG替代辅助噬菌体M13KO7 g3p基因组中5’端的第1和第2个密码子GAA，从而构建了辅助噬菌体Ex12。将M13KO7和Ex12分别感染含有噬菌粒PCMTG－SP112Fab(抗丙酮酸脱氢酶 Fab抗体片段)的抑制性菌株 XL－Blue MRF’，结果表明Ex12的展示水平提高了50倍，亲和性提高了100倍。

1.3 抗体库的种类

一般可分为免疫抗体库和非免疫抗体库。免疫抗体库是采用免疫后淋巴细胞的V基因构建的文库，亲和性高，多样性差。Michael D.Gunn 等［10］通过筛选抗hTLR2的抗体库，发现该抗体库可以产生抗鼠源TLR2抗hTLR5、抗hTLR6抗体，并且对hTLR2均无交叉反应，证明某抗体库如果能产生针对某蛋白家族中的一种抗体，则也有可能产生针对该家族的其他成分抗体，这有助于增加免疫抗体库的多样性。非免疫抗体库又包括天然抗体库、半合成抗体库和合成抗体库。天然抗体库基因来源于未经免疫的供体。半合成抗体库是指人工合成CDR3部分，再与可变区基因组合构建的抗体库。全合成抗体库即人工合成全部可变区基因构建的抗体库。

根据抗体基因动物来源可分为鼠源抗体库、人源抗体库、兔源抗体库、驼源抗体库等。治疗性抗体的临床前研究通常得益于鼠源抗体库的开发，但是仅用于分离 mAbs的鼠源抗体库［11－12］则很少报道。R.Sommavilla［13］等突变抗体可变区的CDR3部分构建了3个鼠源scFv抗体库，库容都在1×109以上，但是其中只有一个抗体库能够对筛选过程中使用的各种抗原(包括3种肿瘤抗原)都能够产生高质量的抗体，这项实验有助于鼠病理模型的建立。兔抗体库优于鼠抗体库，这是因为在免疫应答过程中兔的抗体基因重排较少。Mikhail Popkov［14］等分析 228 例兔抗体的 CDR3，发现兔的重链CDR3比鼠更接近人类。驼源性抗体仅由重链构成，称为重链抗体。由重链的VH组成的抗体称为纳米抗体。该抗体有易表达、水溶性强、耐高温等特性，是工程化抗体的良好来源［15］。人源化抗体是当前抗体工程的研究热点。Zhong［16］等对半合成的人源ScFv文库进行筛选，成功获得HBV、HCV、HEV等各种抗原的人源性ScFv。

1.4 抗体库中展示抗体片段的选择

噬菌体可以有效地展示单链可变区片段(scFv)、异二聚体的抗原结合区片段(Fab)、二硫键稳定性抗体(dsFv)和双价抗体(diabody)。大多数文库采用的是scFv，但也有一些采用Fab。Fab和scFv分子小，结构简单，易于穿过组织，表达效率高，有利于肿瘤等疾病的治疗［17］。Fab含有两条链，具有难组装、产量低的缺点，但是比scFv更稳定，不存在二聚体现象。scFv的主要问题是易于形成二聚体，但是较易合成，耐受性好［18－19］。

2 噬菌体抗体库的筛选

在运用噬菌体抗体库技术制备高质量的单克隆抗体时，筛选起了至关重要的作用。噬菌体抗体库的筛选包括淘选和鉴定。淘选即将抗体库与选择的抗原共同孵育，经过“亲和—吸附—洗脱—扩增”的步骤筛选出目的抗体。一般需要3～4轮的淘选，才能得到优质抗体。鉴定包括PCR鉴定、ELASA鉴定、酶切鉴定等。传统的筛选包括:①固相筛选，即将靶抗原包被在固相介质上，加入待筛选的噬菌体，洗脱，并回收高亲和力噬菌体，随后感染大肠杆菌扩增。② 液相筛选，即将靶抗原与生物素相连，再将其固定在包被有链亲和素的磁珠上，在磁场的作用下将非特异性噬菌体和特异性噬菌体分开［20－21］。为了提高筛选效率，对传统的固体筛选方法进行了改进，如将感染过程与筛选过程相关联，产生了选择性感染系统，又如用抗体代替抗原等。

但是传统的方法仅适用于可以纯化的抗原，对于抗原未知且无法提纯的情况就不适用，于是出现了全细胞筛选。全细胞筛选被广泛用于肿瘤细胞筛选，如肺癌［22］、前列腺癌［23］、血癌［24］等。对于一些细胞受体蛋白，可以通过细胞转染的技术，将靶抗原定位于细胞表面，从而以完整细胞进行筛选［25］。噬菌体抗体库也可以用细胞内化进行筛选，通过受体介导的作用，可以将抗体携带的药物吞进细胞内起治疗作用。筛选可内化的抗体前提是抗体能进入细胞内，以便将效应分子带入细胞。由于scFv半衰期短，在体内易降解，又因为受体介导的内化过程通常伴随受体的二聚化，所以内化筛选更适用于Fab抗体片段。

3 噬菌体抗体库的应用

3.1 肿瘤研究方面的应用

利用细胞筛选得到特异性的抗肿瘤抗原的抗体，将特异性抗体与药物前体、酶、细胞因子等偶联靶向定位到肿瘤局部，或者寻找肿瘤标记蛋白是目前研究人员研究肿瘤生物学诊断治疗的主要方向。曲妥珠单抗、利妥昔单抗、替伊莫单抗［26］等都是将单克隆抗体应用于肿瘤治疗的成功例子。Shui等［27］利用肝癌病人的外周血细胞，构建了一个库容为1.7×107Fab的抗体库，用HpeG筛选得到一个特异性结合肝细胞瘤的抗体，这对推动肝癌诊断和治疗具有重要意义。将蛋白质组分析技术与单克隆抗体技术结合，寻找新的生物标记蛋白也是当前的研究热点之一。Sunao Ima［28］等将蛋白质组分析技术与组织芯片微量抗体免疫组化染色技术相结合，成功地从乳腺癌组织中鉴定出了Eph受体A10、TRAIL－R2、Cytokeratin 8，有助于乳腺癌诊断治疗。

3.2 传染病研究方面的应用

噬菌体抗体对于传染病的预防、诊断和治疗，以及疫苗的研制具有巨大价值。目前，艾滋病已经成为传染病第一杀手。Vidita Choudhry［29］等用来自一个具有高度广泛交叉反应中和性抗体(bcnAbs)的HIV无进展感染者的gp140作为抗原筛选一个免疫噬菌体抗体库，得到一种罕见的特异性抗gp41的hmAb，并证明gp140可能含有诱导bcnAbs的保护性抗原表位。这个新抗体的发现有助于研究HIV免疫性和治疗性疫苗。据统计，我国乙肝病毒携带者已达一亿多人，目前的乙肝诊断主要采用的是乙肝五项检查，但是抗HBe-Ab(+)慢性乙型肝炎和HBV慢性无症状携带者中，前S1抗原(+)可表示病毒的复制，提示临床上只检测“乙肝五项”是不够的，补充前S1抗原的测定是十分重要的，可弥补因病毒变异和其他原因造成的 HBeAg( －)“误诊”。Sang Jick Kim［30］等发现一种可以和前S1抗原的一个表位 (Aa 37－45，NSNNPDWDF)结合的鼠源性HBV中和性抗体KR127，随后将该表位突变为S1(NANNPDWDF)，用融合有突变S1标签的血小板生成素的N末端免疫小鼠(该免疫抗原称为nTPO－S1)，构建一个Fab噬菌体展示抗体库，用nTPO－S1筛选出高度特异性的抗体。这种抗体对前S1抗原的特异性是KR127的9倍，这有助于乙肝的辅助检查，也为如何提高已知抗体的特异性提供了一个简便的方法。噬菌体抗体库对动物传染病的防治也作出了巨大贡献。Yuelan Zhao［31］等构建了一个艾美球虫裂殖子单链抗体库，用冷冻保存的艾美球虫裂殖子进行淘选，筛选出的单链抗体可以在艾美球虫裂殖子表面准确定位，具有高度的特异性和亲和性，这为球虫病的诊断治疗和疫苗的制备提供了有力的工具。

4 展望

噬菌体抗体库技术的出现和应用是生物技术领域中又一里程碑，使人们可以不经过免疫而制得单克隆抗体。噬菌体抗体库最大的优点是实现了表型和基因型的统一，把抗原识别能力和扩大生产的能力相结合，在人源性抗体的制备和筛选方面占有巨大优势［32］。一个好的噬菌体抗体库应该是库容量大，多样性良好。影响库容的主要因素是筛选技术和大肠杆菌转化效率。优化筛选技术对抗体库的质量至关重要。影响多样性的因素主要是目的基因引物的优化和PCR的过程。合理的引物设计是抗体库多样性的关键，尤其是在天然抗体库中，直接影响着所构建的抗体库是否能够真实地反映原始基因的分布。另外，最近有文献报道，抗原的免疫过程也会影响抗体库的质量。Mai Yoshikawa［33］等分别给4组小鼠免疫纯化的 HIV －1 Nef蛋白 25 μg、HIV －1 Nef蛋白 10 μg、HIV －1Vif蛋白 25 μg、HIV －1Vif蛋白 10 μg。14 d之后相同方式再次免疫，28 d之后对10 μg的小组再次进行10 μg的剂量免疫，收集样品，构建抗体库。结果25μg免疫剂量的小鼠组筛选得到的特异性抗体克隆明显多于10 μg给药的小鼠组。如何提高噬菌体抗体库的多样性和库容还有待人们技术探索。目前美国FAD所批准的治疗性抗体和绝大多数临床试验的单克隆抗体几乎都是长为150kD的IgG1［34］，这种高分子蛋白不易穿透组织，且不易与靶分子定位，但是小分子抗体在体内半衰期短，且易发生二聚化，如何解决这些矛盾也是噬菌体发展过程中的难题。当前最热门的研究是完全人源化抗体，主要是通过筛选噬菌体人源抗体库和基因工程小鼠制备。但是人源化抗体也有自身难以克服的困难，如人源化过程繁复、昂贵，需大量的电脑模拟，工作量非常大等。总而言之，噬菌体抗体库技术还处在发展之中，需要继续完善和优化。

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