人体活检穿刺组织、实验动物组织荧光制片、HE制片中的技术改进

王晓鸿 孟晓军 郑燕璇 曹婉维

人体活检穿刺组织、实验动物组织荧光制片、HE制片中的技术改进

王晓鸿 孟晓军 郑燕璇 曹婉维

目的人体活体行肺、肝、肾穿刺及实验用动物的肺、肝、肾组织制作免疫荧光切片、石蜡HE切片，用以明确疾病的性质以及做科研时动物试验的组织进行科学病理分析。方法我院患者的活检组织标本、试验室的动物组织标本取1/4及1/3用普通胶水代替OCT包埋剂，冰冻机下行冰冻切片用以制作直接免疫荧光染色。剩余标本组织在脱水机改进时间后进行脱水处理，行石蜡包埋切片做HE染色。结果组织荧光制片效果好，无背景着色，切片完整，组织结构清晰。组织石蜡HE切片染色胞浆分明，切片完整。两种制片镜下观察定位准确。结论采用改进后方法制片，节约资金，制片的阳性强度及阳性检出率与未改进前相比效果好，定位准确。

活检穿刺组织;实验用动物组织;胶水包埋;冰冻切片;石蜡标本常规脱水处理的改进;直接免疫荧光染色;HE染色

随着医学科技的进步及科研方法的需要，在CT、B超引导下行肺、肝、肾穿刺，进行病理检查，以明确疾病性质以及做科研时动物试验的组织标本进行病理分析，这些都需要应用病理技术来处理以上各种组织进行直接免疫荧光染色及石蜡切片的HE染色等等。荧光染色、石蜡切片HE染色的质量直接影响到对患者诊断的判断及科研工作的成败。由于活检肝、肾、肺穿刺组织及试验用动物组织标本珍贵，组织小、质地稚嫩、柔软、易碎等特点，如果按着常规标本的处理方法，往往容易造成组织过度收缩、脆裂、失去柔韧性，切片时呈碎渣样，不能完整制片，甚至无法制片［1］。直接荧光免疫染色主要观察各组织在某种疾病中的变态反应及其病因、发病机制，所以在标本中显示的抗原或抗体是很关键的，我们使用冰冻切片行荧光抗体抗原染色。要制作优良的荧光切片，各环节都非常重要。首先冰冻制片中包埋剂的使用很关键，包埋剂包埋组织(-20℃ ～-25℃)冷冻后对组织起到支托固定的作用，常规制作冰冻切片使用的包埋剂是OCT，在多年的临床工作中，我科使用普通胶水代替OCT包埋，所制冰冻切片用于荧光染色与使用OCT包埋剂所制荧光切片效果相同，现将摸索出的小组织制片方法介绍如下。

1 材料与方法

1.1 材料 所有穿刺组织均为中山大学附属第五医院患者的穿刺组织、动物试验动物组织为我院中心试验室科研用动物;普通胶水;冰冻切片机(-20℃ ～-25℃);荧光抗体;PBS冲洗液;全封闭式脱水机;石蜡包埋前组织固定、脱水、透明、浸蜡用的各种试剂。

1.2 方法

1.2.1 制作直接免疫荧光染色［2］将组织置于冰冻机中用普通胶水包埋［3］，在-20℃ ～-25℃温度中组织迅速凝冻固定。取下托架后置于冰冻机冷冻头上(冷冻头设定温度为-15℃左右)，开始修切组织至合适时留片，切片要求尽量薄切，以利抗原抗体接触和镜检。取出切片用吹风机冷风吹干固定，PBS冲洗3次，每次3分钟，甩去PBS加荧光抗体30 ul，置于37℃温箱孵育18～30 min取出，PBS冲洗3次，每次3分钟，甩去PBS，缓冲甘油封片避光保存，荧光镜下观察。

1.2.2 荧光制片取材后剩余标本组织做HE染色［4］①标本立即置于中性缓冲甲醛固定液中固定，如果标本过小，可先点上伊红用擦镜纸包起来放进固定液中固定，可防组织丢失。固定液要保持新鲜，液量要求充足，固定时间为1～12 h;②脱水处理［5］:85%乙醇50 min→90%乙醇50 min→95%乙醇Ⅰ90 min→95%乙醇Ⅱ90 min→无水乙醇Ⅰ90 min→无水乙醇Ⅱ90 min;③二甲苯透明处理:二甲苯Ⅰ15 min，二甲苯Ⅱ25 min;④浸蜡处理:石蜡Ⅰ120 min，石蜡Ⅱ50 min，石蜡Ⅲ90 min;⑤包埋;⑥切片、烤片、HE染色。

2 结果

用胶水包埋的组织作冰冻切片凝冻迅速，切片时质感均匀，切片完整，留片后胶水在玻片上容易用水洗净，同时组织不易脱落，直接免疫荧光着色清晰，无背景着色，荧光阳性强度及阳性检出率与用OCT包埋的冰冻制片着色的荧光切片相比较，效果无差异。同时进行石蜡制片的组织经过脱水处理改进后，制片可保证组织完整，最大限度保持了组织的结构，无碎裂，无过度收缩、变硬、变脆等现象，可制成3 um以下的超薄切片。镜下观察组织结构完整，细胞形态好，细胞染色鲜艳，核浆分明。各种染色均能准确表达，同常规处理的标本效果无异。

3 讨论

固定液要求新配制的缓冲中性甲醛固定液，它对细嫩的组织固定时不会引起强烈的收缩，固定作用较温和，对抗原保存较好，最大限度的保持了组织原有的结构，固定效果好，组织在做各种染色时易着色。脱水时各梯度酒精穿透力强，脱水速度快，对细嫩组织有明显的收缩作用，应严格控制脱水时间。但是，脱水时间不够，会造成因脱水不足致使二甲苯无法置换组织中残留的水份，造成石蜡无法侵入，形成组织标本过软，甚至自溶，无法切片。我们在试验中还观察到，即使脱水很好，二甲苯中透明和石蜡浸润过程中，时间过长，也可使组织变硬、变脆，失去韧性，无法制片，影响镜下判断。通过试验，把二甲苯透明总的时间控制为不超过40 min，石蜡浸润总的时间不超过160 min，制出的切片为优质切片。制作荧光切片，免疫荧光中的标本组织的抗原鉴定和定位直接影响的结果判断与对疾病的诊断，制片中力求保持抗原的完整性，并在染色、洗涤和封埋过程中不发生溶解和变性，也不扩散至邻近细胞或组织间隙中去。冰冻切片作荧光染色原理是用物理的方法低温冰冻被包埋剂包埋的组织块后再切片制片，包埋剂本身与组织不会有任何化学反应，包埋剂(胶水)不会破坏抗原的完整性，不会引起抗原发生溶解和变性、丢失。质量好的包埋剂凝冻时间短，切片时均匀，易切、易展、易用清水洗去残留包埋剂。通过反复试验，认为普通胶水代替OCT包埋来制作冰冻切片，用于直接免疫荧光染色效果与用OCT所制切片效果相同，且经济实惠，为医院降低了成本，也保证了质量。通过我科室临床应用，改进后的组织脱水时间及对包埋剂的选择的改进，效果好，值得向大家推广。

［1］王晓鸿，林宇静，等．肾脏穿刺活检病理标本的制作与体会．中国实用医药，2009，4(29):195．

［2］王泊沄，等．肾活检标本的制作技术．病理学技术，2000:948．

［3］王晓鸿，苟新敏，等．制作冰冻切片对包埋剂的选择及应用．中国实用医药，2009，4(36):217．

［4］王晓鸿，肖佐环，等．肝肾肺穿刺组织及实验用小白鼠组织石蜡制片的处理及改进方法．中国实用医刊，2010，37(19):97．

［5］王泊沄，等．组织切片技术．病理学技术，2000:76．

519000 珠海，中山大学附属第五医院病理科