乳酸菌酸胁迫应答机制研究进展

文 / 金君华 张 昊 郭慧媛 任发政 中国农业大学教育部功能乳品重点实验室

1 概述

乳酸菌的特点是在其生长发酵时产生酸性的终产物，这些终产物的积累会改变其生长的外环境，使一些微生物难以适应，但乳酸菌可以依然存活。这一特点是许多食物可以通过发酵来保存的依据。另外，进入消化道后，乳酸菌要遭遇胃的酸性环境。但除了一些种属外，如Lactobacillus，Leuconostoc和Oenococcus，乳酸菌都是嗜中性的，生长最适pH值在5～9之间。因此，人们对乳酸菌的耐酸性产生了极大的兴趣。目前，有关乳酸菌酸胁迫应答机制的研究正在深入开展中。

2 乳酸菌的耐酸应答

已有的研究表明，至少有两种不同的生理状态可以提高乳酸菌的耐酸性。第一种是在对数生长期，通过非致死的pH值诱导产生耐酸应答（Acid tolerance response of lactobacillus，L-ATR）以提高耐酸性[1～4]；第二种是在进入稳定期后产生一般的胁迫应答（General stress response，GSR），提高耐酸性[5]。虽然在L.acidophilus CRL639中，需要较低的外界pH值才能产生GSR，但一般情况下GSR不依赖于外界环境的pH值。菌体形成生物膜可能是提高耐酸性的第3 种状态，但这仅在变异链球菌中有报道[6～7]。大部分乳酸菌（除了L. lactis ssp. cremoris[8]）都拥有L-ATR能力，能够通过这种应答能力来提高菌体在致死酸性环境中的存活力[2～4]。一般情况下，诱导的L-ATR不仅可以提高乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）的酸耐受性，还可以应对其它胁迫，例如高热、高渗透压或氧激[1]。L-ATR的这种宽范围保护作用在不同种属之间是不同的，对相同的胁迫不会都具有保护作用[9]。在L-ATR后，LAB的L-ATR的蛋白质组学研究表明，在L-ATR后，LAB所表达蛋白质的数目增多[10]，但是只有很少一部分假定的耐酸相关蛋白质被定性地研究过。

目前，已经在L.lactis 和S.mutans中开展了耐酸性的基因水平研究，得到了酸敏感突变株，并找到了酸调节启动子；还通过基因手段实现了耐酸突变株的筛选。总之，生物化学、蛋白组学和基因分析表明，LAB的L-ATR是一个复杂的过程，它涉及到许多种蛋白质的合成和多种机制。

3 耐酸应答机制

3.1 维持胞内外pH值平衡

3.1.1 依靠ATP的质子输出

如前所述，酸胁迫会导致横跨膜pH值梯度的减小。LAB能够在低pH值环境中维持一种宽范围的△pH。一些乳酸菌，包括Lactococci可以维持其内部pH值接近中性，直到外界pH值下降到某阈值以下，内部pH值才开始下降。与其它LAB不同，L.delbrueckii细胞内的pH值与细胞外pH值同时下降，但维持胞内外△pH为1[1]。

（1）F0F1-ATPase

F0F1-ATPase在细菌中普遍存在，但还并不清楚它的分子结构和操纵子。该多聚体酶既能够利用质子合成ATP，又能利用ATP水解提供的能量将质子运送出细胞。在LAB中，后者活性在低pH值环境中会升高，这对于维持△pH是至关重要的[1]。有研究表明，具有一定酸耐受性的Bifidobacterium lactis 和Bifidobacterium animalis，在较低pH值条件下H+-ATPase活性显著增高[4]。目前已获得许多F0F1-ATPase活性有缺陷的LAB突变株，并且这些突变株在低pH值环境中都表现出生长缺陷[1]。最近的研究表明，F0F1-ATPase除了具有电子转移活性外，对于L.lactis的正常生长也很重要[11]。然而，F0F1-ATPase的活性具有一个缺点：它是消耗能量的，这最终可能将阻碍菌体在低pH值条件下的生长[12]。

目前，已有学者研究过编码这种酶的一些操纵子（Operon）。ATP位点包含编码细胞质F1复合物的5 个亚基（α，β，δ，γ，ε）及形成F0膜质子通道的3 个亚基（a，b，c）。在LAB中，atp操纵子具有与其它细菌不同的基因组成[1]，然而，这种差异的显著性还不知道。在低pH值中，F0F1-ATPase活性的刺激可能是由于atp位点的转录子积累造成的（这在L.acidophilus和口腔链球菌研究中有报道），也可能是构成酶的亚基的稳定性造成的（这在E.hirae中有报道）。在所有的LAB研究中，L-ATR的2D蛋白质组学分析均表明，胞质F1复合物所有或部分亚基都呈现了上调表达[10]。但是在Oenococcus oeni中，ATPase的活性在低pH值中没有显著性地增加，但ATPase突变株的酸耐受性发生了改变。初步的结果表明，存在多个不同最适pH值的ATPase[13]。

（2）K+-ATPase

阳离子转运ATPase，例如K+-ATPase在维持pH值的平衡中具有作用[1]。K+和H+的交换能够使K+-ATPase产生的横跨膜电势（△ϕ）转化为横跨膜pH值梯度（△pH）。这种离子的交换允许建立△pH，并且能够参与到pH值平衡维持中。例如，生长在pH值为5.0的Streptococcus mutans中，葡萄糖供能的细胞能够将细胞内pH值维持在5.5或者6.1。

3.1.2 基础化合物的产生

（1）精氨酸脱氨基酶

pH值平衡的另一个机制就是精氨酸脱氨基酶途径（Arginine deiminase pathway，ADI）。有3 种酶，即精氨酸脱氨基酶、鸟氨酸氨基甲酰转移酶和氨基甲酸酯激酶构成了这个途径，使精氨酸向鸟氨酸、氨水和二氧化碳转化，并且1 mol精氨酸可形成1 mol ATP。生成的NH3与H+发生反应，利于碱化环境，产生的ATP能够使F0F1-ATPase将质子运送出细胞外。另外，精氨酸/鸟氨酸的逆向转运子允许这2 个分子在没有任何能量消耗的状态下实现交换。Marquis等人发现，在有45 mM的精氨酸存在时，L.lactis可以在几个小时内将胞外的pH值从4.0提高到6.5[1]。ADI在许多LAB中都能检测到，但是对于耐酸性的直接影响还没有被报道。另外，已有研究显示，与ADI调节直接相关的刺激因子应该是精氨酸的存在，能量的消耗，新陈代谢受到抑制，以及氧化作用[14～15]，而不是低pH值。因此，尽管ADI活性能够碱化环境，但在不同菌种中，它对LAB耐酸性的重要性是不同的。

（2）脲酶

脲酶的活性可以在牛奶S.thermophilus和口腔细菌S.salivarius中检测到。既然尿素在唾液中存在，那么尿素的分解对于S.salivarius在极端酸性环境中的生存就可能尤为重要，因此主要在后者中开展脲酶的研究。脲酶能够催化尿素水解为CO2和氨水，这样可以碱化环境，提高pH值。在有25 mM尿素存在的条件下，pH值3.0的细胞能够将外界pH值提高到7.6，相对于没有尿素的处理组，其存活率可提高1 000 倍[16]。通过过量消耗碳水化合物，复杂的尿素操纵子可以在低pH值环境中脱除阻遏。

（3）脱羧反应和电子转运

在LAB中发现，脱羧反应和电子转运的一些系统对于维持pH值平衡具有作用。在一些反应中，1 个羧基酸化合物（比如氨基酸）被转运到细胞中，然后被脱羧。在反应中，1 个质子被消耗，然后产物通过转运子被输出细胞。这个反应最后可提高细胞质中的碱性。另外，通过脱羧反应和1 个电子转运子可形成质子动力势（Proton motive torce，PMF）从而产生ATP。这些反应与耐酸性的关系是在L.lactis中的谷氨酸脱羧酶（Glutamic acid decarboxylase，Gad）系统中建立出的。在氯化物和葡萄糖存在时，1 个gad缺失突变株的酸敏感性是野生株的1 000 倍[17]。Gad在肠道原核生物中是很常见的。有学者假设过这种酶的存在可使细菌通过胃环境时变得强大[18]。

苹果乳酸发酵是双羧基苹果酸与单羧基乳酸之间的转换。细菌产生的L-乳酸是通过乳酸-苹果酸反向转运子或电子单向转运排出的，后者可以在低pH值中合成ATP。这种ATP产物很可能在O.oeni耐酸性中发挥作用[19]。

（4）终产物的电子转运

已经研究过，L.lactis在中性和低pH值中排出的乳酸。在中性pH值条件下，排出过程是生电的，有利于PMF的产生；在低pH值条件下，这种转运是电中性的，不利于膜电势的产生。Koebman等人研究表明，L.lactis的F0F1-ATPase失效菌株不能在pH值7.0的培养基中形成菌落。这个发现表明，在中性pH值条件下，乳酸的排出不能产生足够的能量来保证细胞的生长[20]。

3.2 细胞膜脂肪酸构成的变化

细胞膜很可能是生理胁迫的首要目标之一。细胞膜脂肪酸构成的变化是对环境胁迫的一般性应答。在E.coli中，脂肪酸修饰在保护细菌免受酸胁迫中发挥着重要的作用[21]。S.mutans可以对于适应酸化环境的原因之一是细胞膜上具有含量丰富的单不饱和长链脂肪酸，这使得细胞膜对于质子的通透性降低[22]。在S.mutans中，dlt操纵子的失活与脂磷壁酸的D-丙氨酸酯化反应有关，使生长状态改变[23]。突变株比野生株更具有酸敏感性，这可能与高质子渗透性有关。在L.lactis中，某个与肽聚糖合成相关的青霉素绑定蛋白质的失活增强了酸敏感性[1]。这些数据表明，细胞壁的组成在酸耐受性上具有一定的影响，很可能是与细胞表面特性的改变有关，或者还有有利于维持酸胁迫环境细菌细胞壁完整性的其它系统存在。

首先，在O.oeni中，1 个小的热激蛋白（smHSP）Lo 18，在热处理、乙醇处理和酸处理后被诱导。原核生物的smHSP与有脊动物眼睛的α－晶状体蛋白具有同一个保守序列。胁迫处理被诱导很可能与这个蛋白质在其它伴侣蛋白的共同作用下重新折叠成变性蛋白有关。有趣的是，Lo 18在热胁迫之后可以变成主要的膜相关物质，可以被膜的流化作用诱导表达。这些数据表明，Lo 18可能与热胁迫或酸胁迫后膜或壁蛋白的稳定性有关[24]。

第二，S.mutans的Ffh蛋白在耐酸性中发挥作用。在E.coli中，Ffh参与处理膜与胞外蛋白质运输的信号识别粒子（Signal recognization particle，SRP）转导路径。在S.mutans中，ffh基因会被低pH值诱导上调表达。ffh突变株比野生株更具有酸敏感性，并且在酸胁迫中不能够快速地提高F0F1-ATPase的活性[25～26]。这种表型或许反映了SRP系统在F0F1-ATPase转导中的作用及其它酸诱导蛋白向膜内转导的作用。

3.3 受损蛋白质的修复

除了可能发挥分子伴侣作用的O.oeni中的Lo 18和S.mutans中的Ffh蛋白外，在一些LAB的L-ATR的蛋白组分析中发现，热激分子伴侣总是上调表达。这些蛋白质很可能是修复酸诱导损坏的蛋白质或辅助新合成蛋白质的折叠。尽管热激蛋白DanK和GroEL一般会被鉴定出来，但在不同种属中，酸诱导的热激蛋白是不同的[3，10]。对S.mutan中的danK和groE操纵子进行的特异性研究结果表明，低pH值的诱导是由它们普遍的热激调节子HrcA和CtsR中间介导的[5，27]。

3.4 受损DNA的修复

细胞内的酸化可引起DNA的脱嘌呤或脱嘧啶。这个机制与糖基键断裂后的碱基质子化作用有关。参与碱基缺失的位点称为碱基缺失位点（AP位点）。在L.lactis中，一个适度的UV辐射可以诱导提高针对多种胁迫的耐受性，包括酸胁迫，并且有4 种蛋白质在酸诱导中出现上调，它们都是由DNA损坏处理诱导的。这表明L-ATR或许含有DNA修复系统[28]，这种假设在S.mutans中得到验证。在S.mutans中，L-ATR通过酸环境诱导了不依赖RecA的DNA修复系统，从而提高了菌体DNA对损坏的耐受性[9]。进一步研究表明，在低pH值下，野生型和recA缺失菌株S.mutans展现了针对AP位点的核酸内切酶活性，并且uvrA基因得到诱导表达[28]。uvrA突变株启动完整的L-ATR保护的能力下降，并且在低pH值条件下，DNA降解的程度更严重一些[29]。Uvr系统是被DNA螺旋变形激活的，然而AP核酸内切酶活性通常通过碱基切除处理修复小的DNA损坏区域。因此，很可能在酸胁迫中2个系统共同工作。

3.5 耐酸系统的调节

双组分系统通常与细菌对环境的适应有关。在L.lactis和L.sakei中，一些双组分突变株展现了与耐酸相关的表型。双组分系统在耐酸性中可能的相关性是表明酸度外部信号的存在[1]。一项最近的研究表明，S.mutans具有与群体效应感受相关的外部信号系统，这刺激了它的酸耐受性。尽管有能力的刺激因子参与到了信号中，但仍需要另一因子来获得完整的耐酸诱导。一些胞内系统能够在酸或其它胁迫的耐受性的控制中发挥一些作用[6]。L.lactis的高亲和度磷酸转运子的失效突变株对于H2O2和酸性pH值具有很高的耐受性[30]。很可能像在B.subtilis中研究结果一样，磷酸限制诱导了包括胁迫耐受基因的调节子[31]。既然之前的研究表明低pH值能够降低磷酸转运子的活性，那么磷酸控制调节子很可能在L-ATR中发挥着作用。在L.lactis中，与鸟嘌呤核酸代谢有关的基因guaA（GMP synthetase）和relA[（p）ppGpp synthetase]失活，导致菌株对酸、热激和葡萄糖营养饥饿耐受性的提高[30]。在S.mutans中，SGP（Streptococcus GTP-Binding protein）蛋白与GTPase的普遍Era亚家族具有同源性，或许与酸耐受性有关[32～33]。SGP的可能功能之一就是调节GTP/GDP系统。值得注意的是，SGP的表达量和它与膜的相关性在胁迫的环境下同时升高。因此，可以提出假设：作为胁迫感受器的核糖体[34]，可根据它的活性调节（p）ppGPP合成RelA[1]，及感受或调节GTP/GDP比例的SGP是进行完整调节管理的作用者[33]。

4 展望

由于乳酸菌具有的较高的工业应用价值，有关乳酸菌在各种环境中的胁迫反应机制已成为研究的焦点之一。随着新技术在基因和蛋白质研究领域的应用，乳酸菌酸胁迫反应机制研究将取得更大的进展。

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