绵羊弓形虫病的ELISA诊断

铁富萍，李 春，刘永林

（青海省海晏县畜牧兽医站，海晏 812200）

绵羊弓形虫病的ELISA诊断

铁富萍，李 春，刘永林

（青海省海晏县畜牧兽医站，海晏 812200）

弓形体病（toxoplasmosis）又名弓形虫病或弓浆虫病，是由刚地弓形虫（toxoplasme gondii）引起的人畜共患的寄生虫病，其病原体是一种专性细胞内寄生的致病原虫，在自然界广泛分布，寄主范围广，可感染人和猪、马、牛、羊、狗、猫等多种动物，其临床表现多样，从无症状隐形到亚临床到显性、重症以致死亡，主要侵害幼畜和新生仔畜，羔羊发病后常表现为免疫力低下、生长缓慢、消瘦、贫血以及呼吸系统和神经系统症状，严重时可引起死亡，怀孕母羊感染后常引起广泛病变而导致流产、不孕、死胎［1］，造成繁殖障碍。为了摸清青海省海晏县羊群中弓形体病的感染情况，我们于2009年8月，应用ELISA方法进行了弓形虫的抗体检测，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 抗原 P30由日本国家原生动物疾病研究控制中心提供，青海省畜牧兽医科学院兽医所生物技术研究室保存。P30简介如下：编码T.gondii的表面抗原l（SAGl，P30）被克隆到PGEX-4T-3质粒上，再表达在E.coli上。

1.2 被检血清的采集和处理 94份被检血清均采自青海省海晏县哈勒景乡永丰村的流产较严重的绵羊群中的生产母羊，采血时均空腹、颈静脉采集，采集后摆成斜面，置4℃冰箱5 h后，放在室温待血清析出后收集血清，-20℃冷冻保存待检。

1.3 其他试剂和耗材 均购自国内和Sigma公司供应商。

1.4 ELISA

1.4.1 抗原的包被 抗原GST-SAG1t和GST，按5 μg/mL剂量加到包被液中（50 mmol/L carbonate bicarbonate buffer，pH 9.6），混匀后加到 96 孔平底微量板（castor）的孔里，每孔50 μL，在4℃条件下培养过夜。

1.4.2 封阻 用含有0.05%Tween 20的PBS冲洗液冲洗1次后，残留粘附物的部位用含3%脱脂乳的封阻液（3 g脱脂乳粉+90 mL蒸馏水+10 mL 10×PBS液）进行封阻，每孔100 μL，并在37℃条件下培养1 h。

1.4.3 加样 随后微量板用冲洗液冲洗6次，在封阻液中按1∶100滴度稀释被检血清后，每个样品平行加到微量板的两个孔中，每孔50 μL，并在37℃条件下培养1 h。

1.4.4 加二抗 用冲洗液冲洗6次后，在封阻液中按1∶4 000滴度稀释辣根过氧化物酶结合了绵羊的IgG抗体，稀释后每孔加50 μL，并在37℃条件下培养1 h。

1.4.5 底物 用冲洗液冲洗6次后，每孔加100 μL底物（每毫升底物中含有0.3 μg ABTS，0.1 mol/L的柠檬酸缓冲液pH 4.0和0.003%H2O2），在室温阴暗处放置1 h后读数。

1.4.6 读数 用Wellscan MK 3酶标读数仪（Labsystems Dragon，Finland）在光吸收值OD 415nm条件下测定光吸收值（OD）。

1.4.7 判定标准 ELISA滴度表示成最大稀释度的倒数，且展示ELISA值是等于或大于0.1，在抗原GSTSAG1t孔和GST孔之间的光密度吸收值是不同的，两个孔之间的差值为该被检样品的光密度吸收值（OD值）。两孔阳性血清对照孔的平均值必须大于0.1；两孔阴性血清对照孔的平均值必须低于0.1；两孔待检样品的平均值等于或大于0.1为阳性，低于0.1为阴性。

2 结果

调查表明，所检测的110份被检血清中，共检出T.gondii抗体阳性血清14份，阳性率12.73%。

3 讨论

3.1 通过本次检测海晏县的110份绵羊血清，检测出阳性14份，阳性率12.73%，这比王晓燕报道［2］的海晏县绵羊弓形虫病的感染率4.22%高3倍，比张晓强等报道［3］的天俊县土种藏系羊弓形虫病的感染率3.70%高4倍。说明海晏县的绵羊群中存在弓形虫病的感染，要引起有关部门的高度重视，应采取相应的防制措施。并定期对海晏县全县的绵羊群进行弓形虫病的血清学检测，检出阳性及时淘汰，净化本病，从而使海晏县的畜牧业经济保持稳定的发展。

3.2 本研究采用了一个具有免疫原性的表面T.gondii的抗原l（SAGl，P30）。编码T.gondii的表面抗原l（SAGl，P30）被克隆到PGEX-4T-3质粒上，随后谷丙酰胺转移酶融合蛋白一样被克隆表达在E.coli上。重组的SAGl（rSAGl）被重新折叠在8M的尿素溶液，接着透析，最后用ELISA方法在弓形虫病的血清学诊断上进行了评估，ELISA方法在弓形虫病的血清学诊断上具有敏感、特异的特点。

3.3 弓形虫是寄生于人和哺乳动物组织细胞内广泛分布的机会性致病原虫，与这些动物的亲密接触和食用这些动物的肉类尤其是生的或半生不熟的肉类是导致人类感染的主要原因之一。加强中间宿主猫的管理，尽量少养猫或不养猫，防止猫进入圈舍，严防猫的粪便污染草场、食物和饮用水，凡是可能被污染的草场，均用较强的消毒剂进行消毒来杀死草丛中的卵囊，并加强灭鼠工作，各种肉食品在使用前均应充分煮熟，不吃生的或半生不熟的肉类和生乳等，切生、熟肉的用具应分开。发现猫感染弓形虫病要及时淘汰，也可用药物进行治疗，确保人畜安全。治疗药物有乙胺嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺六甲嘧啶、敌菌净和乙酰螺旋霉素、克林霉素等。

致谢：在采血过程中得到青海省海晏县各乡镇畜牧兽医站同志的帮助，在检测过程中得到青海省畜牧兽医科学院马利青、蔡其刚等老师的帮助，在此一并致谢。

［1］朱锦沁，袁生馨.高原人畜共患病［M］.西安：陕西人民出版社，1994.

［2］王晓燕.青海省海晏县绵羊弓形虫病的血清学调查［J］.青海省畜牧兽医杂志，2007，37（4）：29.

［3］张晓强.天俊县土种藏系羊弓形虫病的血清学调查［J］.青海省畜牧兽医杂志，2009，39（1）：29.

2011-02-24

铁富萍（1976-），男，兽医师。

1007-9726（2011）03-0071-02

S858.26