牦牛新孢子虫病ELISA检测

铁富萍，李德寿，李 娟

（青海省海晏县畜牧兽医站，海晏 812200）

牦牛新孢子虫病ELISA检测

铁富萍，李德寿，李 娟

（青海省海晏县畜牧兽医站，海晏 812200）

牛新孢子虫病是由犬新孢子虫（Neospora caninum）寄生于犬、牛、绵羊、山羊、马等动物的中枢神经系统、肌肉、肝及其他内脏引起的一种原虫病，可使孕畜发生流产或死胎，新生胎儿发生神经系统和运动障碍等［1-3］。犬和郊狼是其终末宿主。新孢子虫隶属顶复门、孢子虫纲、真球虫目，现已广泛分布于北美、欧洲、澳大利亚和新西兰等国家或地区，在羊、山羊、鹿、犀牛和马上广泛流行，且在水牛、红狐、灰狐、北美草原小狼、骆驼和猫科动物中已经报道发现了N.caninum血清抗体。新孢子虫对牛的危害主要是妊娠母牛流产或产死胎、弱胎、木乃伊胎，从而造成乳牛或肉牛的生产性能降低而被淘汰［4］，严重威胁养牛业的发展。为明确青海省海晏县牦牛新孢子虫病感染情况，笔者等于2009年8月，对海晏县牦牛进行N.caninum抗体检测，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 犬新孢子虫重组蛋白GST-NcSAG1t，在前期研究中进行了克隆、表达和纯化；阴、阳性标准血清，均为日本国家原虫中心玄学南博士惠赠，由青海省畜牧兽医科学院兽医所生物技术研究室保存；其他试剂均购自国内或Sigma公司。

1.2 被检血清的采集与处理 135份被检血清均采自青海省海晏县自然放牧的牦牛群，均空腹、颈静脉采血，采集后摆成斜面，置4℃冰箱5 h后，室温下析出并收集血清，-20℃冷冻保存待检。

1.3 ELISA检测步骤

1.3.1 抗原的包被

按5 μg/mL剂量将抗原GST-NcSAG1t和GST加入包被液中（50mM碳酸盐缓冲液，pH9.6），混匀后注入96孔平底微量板（Nunc，Denmark），每孔50μL，4℃培养过夜。

1.3.2 封阻 用含有0.05%Tween-20的PBS冲洗1次后，残留的粘附物用含3%脱脂乳的封阻液进行封阻，每孔 100 μL，37℃培养 1 h。

1.3.3 加样 用冲洗液冲洗微量板1次，在封阻液中按1∶100滴度稀释被检血清后，每个样品平行加到微量板的两个孔中，每孔 50 μL，37 ℃培养 1 h。

1.3.4 加二抗 用冲洗液冲洗6次后，在封阻液中按1∶4 000滴度稀释辣根过氧化物酶结合的山羊抗牛IgG抗体（BethylLaboratories，USA），后每孔加入50μL，37℃培养1h。

1.3.5 底物 用冲洗液冲洗6次后，每孔加入底物100μL，每毫升底物中含0.3 mg的2，21azino bis（3 ethylbenz thia zoline 6 sulfonic acid）、0.1 mol的柠檬酸、0.2 mol的磷酸缓冲液和0.003%H2O2，每孔加入量为100 μL。

1.3.6 测定 用Wellscan MK 3酶标读数仪（Labsystems Dragon，Finland）在415 nm条件下测定光吸收值。

1.3.7 判定标准 用最大稀释度的倒数表示ELISA滴度，抗原GST-NcSAG1t孔和GST孔之间光密度吸收值之差作为该被检样品的光密度吸收值。两孔阳性血清对照孔的平均值须大于0.1；两孔阴性血清对照孔的平均值须低于0.1；两孔待检样品的平均值等于或大于0.1为阳性，低于0.1为阴性。

2 结果

结果表明，所检测的135份被检牦牛血清中，共检出N.caninum抗体阳性血清5份，阳性率3.7%。

3 讨论

3.1 本次共检测海晏县牦牛血清135份，检出N.caninum抗体阳性血清5份，阳性率3.7%，表明海晏县牦牛群中存在N.caninum感染，但该感染率低于马利青等［5］报道的青海省牦牛N.caninum的感染率11.6%（21/181）和晁万鼎等［6］报道青海省格尔木市乳牛N.caninum的感染率 11.42%（4/35）。

3.2 由于N.caninum的表面抗原NcSAGl与T.gondii的SAGl在遗传上同源，两者之间具有交叉反应，因此一些学者认为在使用SAGl时易产生假阳性结果，但大量的实验数据证明，用SAGl作为ELISA诊断抗原检测T.gondii人工感染鼠时，未发生交叉反应。另外的研究也证实，用重组的T.gondiiSAGl作为ELISA诊断抗原检测N.caninum人工感染鼠时也不发生交叉反应，故认为NcSAGl是检测动物N.caninum感染的重要诊断抗原之一。该试验进一步证实，重组蛋白NcSAGlt作为ELISA诊断抗原，具有灵敏性、特异性等特点，为今后开展该领域流行病学调查奠定了坚实的基础。

3.3 预防牦牛新孢子虫病，需加强检疫工作，防止和杜绝引进带病牛，定期进行血清学检测，检出阳性者及时淘汰或治疗，防止犬粪污染草场、饮水和饲料，草场圈舍要定期消毒。禁用可能感染的内脏喂犬，加强灭鼠工作。

致谢：在检测过程中得到青海省畜牧兽医科学院马利青和蔡其刚老师的指导，特此致谢。

［1］杨光友.动物原虫学［M］.成都：四川科学技术出版社，295.

［2］马少丽，马利青.绒山羊犬新孢子虫病的血清学调查［J］.中国兽医杂志，2006，42（9）：25-26.

［3］马利青.柴达木地区黄牛新孢子虫病的ELISA检测［J］.畜牧与兽医，2006，38（4）：46-47.

［4］于晋海，刘群，夏兆飞.牛新孢子虫病和弓形虫病的流行病学调查［J］.中国兽医科学，2006，36（3）：247-251.

［5］马利青，沈艳丽.青海牦牛新孢子虫病的血清学诊断［J］.中国兽医杂志，2006，42（9）：33-34.

［6］晁万鼎，马利青，李文昌，等.青海省格尔木市乳牛新孢子虫病的血清学调查［J］.中国兽医科技，2005，35（12）：1010-1014.

2011-03-15

铁富萍（1976-），男，兽医师。

1007-9726（2011）03-0066-02

S858.23