制作冰冻切片的体会①

吴江锋,李红军

(三峡大学医学院,湖北 宜昌 443003 E-mail:313229177@qq.com)

冰冻切片具有制片迅速、简便、切片较薄、组织变化不大、无需脱水及浸腊等特点[1],能很好地保存类脂、脂肪等成分,尤其在免疫组织化学染色中,更能完好地保存大部分的抗原活性及各种酶类。尤其对有机溶剂或热温度耐受差的细胞表面抗原和水解酶的保存就更好。常用于临床诊断和科学研究。要制作高质量的冰冻切片并非易事,受到多种因素的影响。笔者通过多年的实践总结了一些体会,供同仁们参考。

1 材料和方法

1.1 仪器及试剂 德国Leica-CM1900型恒温冷冻机、一次性切片刀片、普通胶水、甲醇、苏木精染液、2%盐酸、蔗糖、明胶。

1.2 切片前的准备

1.2.1 冰冻切片机的准备 冰冻切片机在备用状态下,设置夜间除霜,白天根据不同标本预设温度,避免经常开关机。使用前将刀架与组织块的角度调整好,调节好防卷板的位置,保持防卷板干净、平整,冻头清洗干净[2]。

1.2.2 载玻片预处理 将载玻片用1%HCl浸泡0.5h,捞出用清水冲洗干净再用95%的酒精浸泡10min,蒸馏水洗净,烤干后备用。

1.2.3 托物台预处理 将数个托物台放入-20℃冰箱中预处理10min左右。

1.3 取材 动物和人死后2h内材料均可供取。材料越新鲜越好,取材要快速准确平整。厚度一般＜2cm×2cm×2cm。

1.4 包埋 细小的组织需用普通胶水包埋,对破脆较小的组织标本,预先用少许胶水涂于切片托上做一冰台,垫高后再放小块组织进一步冰冻。特殊的标本用蔗糖和明胶,其余均可直接放置速冻台。

1.5 切片 切片前要仔细观察组织块的变化,组织在冷冻过程中,从周边开始变白,最后中间留下绿豆大小的反光区,很快消失,这时及时固定组织托并开始修块,因为最佳的切片温度为-20℃到-23℃,大约10s左右。快速切片。

1.6 贴片 贴片时载玻片与刀面的角度要成40°左右,根据组织块而定,如果防卷板碍事可直接贴。依靠载玻片的热量将组织切片吸起,自然摊平。

1.7 固定染色 切好的片子立即放入甲醇固定液中1～2min。固定液要及时更换。切片从固定液中取出后迅速水洗,苏木精染液中浸染2～3min,然后取出水洗并蓝化。2%盐酸乙醇分化数秒,0.1%氨水之蓝,显微镜下观察染色情况,以核染色清晰为度。伊红缸内燃胞浆数秒,水洗,梯度乙醇脱水,两个二甲苯透明,中性树胶封片。

3 结果

通过上速方法切出的片子,组织结构形态完整,细胞染色清晰,无折叠。

4 讨论

有一台性能良好的冰冻切片机是冰冻切片质量的基础,切片前,冰冻切片机的准备、载玻片和托物台的预处理是切好冰冻切片的必不可少的重要环节。

新鲜、干净、无杂质的材料是冰冻切片的必要保障。材料大小要合适,最理想的取材大小为1.5cm×1.5cm×1.5cm,该规格的材料不需要包埋。若材料太小可用胶水包埋,胶水包埋冷冻迅速,质感均匀,易切出完整的组织切片,易展片,留片后胶水易清洗、组织易分离、价廉、操作方便[3]。对于易脆的组织或者需要连续切片的组织,可用7.5%明胶-15%蔗糖对组织进行包埋,待明胶蔗糖呈凝胶状时,根据需要修块,锡纸包裹后放置到-80℃冰箱进一步冷冻(至少2h),切片前将组织块移至冰冻切片机内复温至少半小时后开始切片,使用7.5%的明胶-15%的蔗糖包埋组织后可以像石蜡切片一样进行连续切片。蔗糖能使组织维持良好的形态、防止某些细胞成分的扩散,并充分保持酶的活性。高浓度的蔗糖具有脱水和防止冰晶形成的作用。明胶溶于水后,能相互吸引、交织。明胶与蔗糖混合后可以使蔗糖和水完全充塞在凝胶空隙内,使组织保持稳定的状态,起到吸水和支撑骨架的作用。

冷冻时间和温度的把握是切好冰冻切片的关键[4]。为了减少冰晶出现,有效防止冰晶挤压周围组织,改变形态结构,需要将组织块快速地移至冷冻头。恒冷箱切片机的室内温度以-15℃到-22℃为宜,而冷冻头的温度要根据组织的性质、软硬度而定。如淋巴结、肝、脾、肾组织,温度设定在-18℃到-20℃为宜;甲状腺、肺组织为-20℃到-22℃;对于质韧、硬的组织如子宫、致密结缔组织的设置温度要达到-23℃到-26℃,切片速度也要相对慢一些,过快会出现跳刀现象;脂肪组织要降至-30℃。切片的时间要把握得当,时间过短冷冻不好,时间过长则会使组织变硬,不仅损伤刀而且组织片也会出现裂痕。经验表明,用戴乳胶手套的拇指轻轻按压回温[5],如组织块变脆应立即升温,也可用手指在组织表面摸一下再切。

切片时其他细节的把握也是提高切片质量的重要补充。切片时切片刀的角度要调整合适,防卷板调整到切片刀5°左右的角度,防卷板的前缘与刀面要有足够的距离,略高于刀刃的最高点,固定好后不要轻易移位,使切出的切片顺利通过刀与防卷板间的缝隙。修块时切忌进刀太慢,避免组织断裂。刀速要均匀,其快慢要根据不同的组织而定。贴片要细心而快速,手部切勿上下移动更不能颤抖,而且在贴附组织时手要有一个向下的伸展动作,片子若有卷曲,可用质量好的毛笔轻轻压切片前缘把切片展平,及时附贴于干净的载玻片上后,立即置于固定液中。固定后的组织可直接染色或完全自然干后储存于-80℃冰箱。此外,切片时,为了防止升温,切片机的盖子打开得越小越好。固定液的选用,我们倾向于甲醇,甲醇具有乙醇的固定作用,收缩性比乙醇小得多,且具有快速固定、染色清晰等优点。

总之,笔者的体会是,要制作好一张优质的冰冻切片,需要控制好各个操作环节,而操作人员一丝不苟的工作态度和责任感是获得完美结果的关键。

[1]陈洁,张雯静,李坚.冰冻切片制作中时间和温度的研究[J].现代实用医学,2010,22(5):587.

[2]曾训,徐洪.控制冰冻切片质量的探讨[J].中国误诊学杂志,2009,9(22):5393-5394.

[3]王晓鸿,苟新敏,林宇静.制作冰冻切片对包埋剂的选择及应用[J].中国实用医药,2009,4(36):217-218.

[4]刘晓兰,刘燕,宋月晗,等.冰冻切片制作体会及常见问题[J].现代生物医学进展,2010,10(14):2738.

[5]李建红,石天峰.冰冻切片制作方法改进探讨[J].长治医学院学报,2007,21(4):306.