三苯氧胺对晚期大肠癌多药耐药逆转作用研究

梁孝印

多药耐药(multidrug resistance，MDR)是肿瘤化疗失败的重要原因，逆转MDR在肿瘤化疗中愈来愈显得重要。MDR与多种因素密切相关，其中最重要的是MDR基因的过度表达与其编码产物P-糖蛋白的增多。大肠癌早期诊断困难，且很多患者因健康状况等原因而不能手术。逆转化疗中出现的MDR，对大肠癌患者显得愈发重要。本研究通过检测外周血淋巴细胞膜P-gp含量，临床筛选产生多药耐药的晚期大肠癌患者，对比观察三苯氧胺预处理对FOLFOX4化疗方案(奥沙利铂联合5-氟尿嘧啶/亚叶酸钙)化疗作用及外周血淋巴细胞膜P-gp含量的影响。

1 资料与方法

1.1 试剂与仪器 鼠抗人P-gp单克隆抗MRK16，免疫阴性对照抗体羊抗鼠IgG，及羊抗鼠IgG-FIFC(异硫氰酸荧光素标记)，均购自法国国际免疫公司;淋巴细胞分离液购自中国医学科学院血液研究所;三苯氧胺为上海华联制药公司产品，奥沙利铂及亚叶酸钙由江苏恒瑞医药股份有限公司生产，氟尿嘧啶由上海旭东海普药业有限公司生产。LD4-2A型低速离心机，北京医用离心机厂;FACScan型流式细胞仪，美国BD公司。

1.2 试验样本

1.2.1 临床资料 62例大肠癌患者均为2009年6月至2010年8月在泰安市中心医院经病理学证实(手术或活检)为大肠癌，均经过3疗程(含3疗程)以上奥沙利铂-氟尿嘧啶方案治疗。所有病例入组前采外周静脉血2 ml，分离淋巴细胞，以流式细胞仪检测淋巴细胞膜 P-gp含量，表达阳性患者入选。入选病例随机分为三苯氧胺组33例和单纯化疗组29例。三苯氧胺组男20例，女13例，年龄33～76岁，中位年龄52岁;单纯化疗组男19例，女10例，年龄31～72岁，中位年龄49岁。P-gp正常对照组，选择住院非恶性肿瘤患者30例，男19例，女11例，年龄21～76岁，中位年龄51岁，测定其淋巴细胞膜P-gp含量，计算P-gp表达阳性界值。

1.2.2 标本制备 外周血淋巴细胞提取及制备参见文献［1］，取静脉血2 ml，以2% 乙二胺四乙酸钠(EDT A)抗凝(1∶9)，加入淋巴细胞分离液2 ml，以1500 r/min离心5 min，提取淋巴细胞，PBS漂洗，1500 r/min离心5 min，2次，去上清，70%乙醇固定。检测前，先以PBS漂洗样品悬液1次，1500 r/min离心5 min，除去固定剂，调整悬液细胞数在109/L左右，再将每份悬液分别加入两试管中，其一加入 20 μl MRK16，其二加入20 μl羊抗鼠IgG(以排除非特异免疫反应误差)，室温放置20 min，2000 r/min离心5 min，共3次，再向两试管中分别加入20 μl羊抗鼠IgG-FIFC，室温避光放置30 min，2000 r/min 离心5 min，3 次，PBS 漂洗，待检。

1.3 外周血淋巴细胞膜P-gp含量检测 用流式细胞仪收集2万个淋巴细胞进行检测，在Macintosh 650型计算机上应用Cell Ques Plot软件(美国BD公司)分析数据结果。P-gp含量以P-gp阳性细胞百分率表示，计算公式为：P-gp阳性细胞%=P-gp阳性细胞数/(P-gp阳性细胞数+P-gp阴性细胞数-非特异结合细胞)×100%。

P-gp阳性判断标准：取正常人外周血淋巴细胞P-gp含量的95%可信限，即均值+标准差为界值×2，检测值大于此值判断为P-gp阳性，小于或等于此值判断为阴性［1］。

1.4 治疗方法 三苯氧胺组于化疗3 d前开始口服三苯氧胺40 mg/d，随后行草酸铂(L-OHP)85 mg/m-2静脉滴入，第1天;亚叶酸钙(CF)200 mg/m2，静脉滴注 2 h，第1～2天;CF后5-氟尿嘧啶(5-Fu)400 mg/m2快速静脉推注，继以5-Fu 600 mg/m2持续静脉滴入22 h，第1～2天，2周为1个周期。化疗组不给予三苯氧胺，仅完成相同FOLFOX4方案化疗。

1.5 临床观察及统计学处理 两组病例均行化疗4个周期后评价疗效，化疗结束后第2天采集血液样本进行外周血淋巴细胞膜 P-gp含量检测。疗效评定标准按 WHO统一标准［2］：疗效分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、稳定(SD)、进展(PD);不良反应分为 0～Ⅳ度。以CR+PR/总例数×100%计算有效率。统计学处理使用SAS软件，计量资料应用t检验，计数资料应用χ2检验，疗效分析应用秩和检验。

2 结果

2.1 正常人P-gp含量 正常人外周血淋巴细胞膜P-gp含量为(1.47% ±0.26)%，计算 P-gp阳性界值：(1.47+0.26)%=1.99%，外周血淋巴细胞膜P-gp含量大于1.99%病例入选。

2.2 P-gp含量变化 两组病例外周血淋巴细胞膜P-gp含量变化见表1。

表1 外周血淋巴细胞膜P-gp含量

2.3 P-gp转阴率 外周血淋巴细胞膜P-gp转阴率，单纯化疗组为7.00%，三苯氧胺组为36.00%。两组比较，三苯氧胺组转阴率明显高于单纯化疗组，(P＜0.01)。

2.4 临床疗效 两组临床疗效比较见表2。三苯氧胺组的总有效率、中位生存期和1年生存率都比单纯化疗组高，两组间比较差异有统计学意义。

表2 两组临床疗效比较

2.5 毒性与不良反应 两组毒性与不良反应基本相同。主要是血液学毒性及消化道反应，但均为Ⅰ～Ш级，在所有病例中均未出现Ⅳ级。经粒细胞集落刺激因子及TH-3受体阻断剂对症处理，所有患者均完成1～3疗程化疗。

3 讨论

多药耐药是指肿瘤细胞由某一抗癌药物诱发产生耐药性，往往同时对其他化学结构和作用机制不同的药物产生交叉耐药的一种现象［2］。化疗后肿瘤细胞产生的多药耐药(MDR)常使化疗难以奏效并最终导致化疗失败。已证明MDR与P-糖蛋白(P-gp)高表达有关。P-gp阳性表达于胰导管上皮，肝细胞的胆管面、小肠和大肠的腔膜面等，这些正常组织阳性表达的主要作用是与拮抗外源性毒素、代谢产物的排泄以及增强细胞吞噬有关［3］。P-gp作为一种ATP酶活性的跨膜泵或“换位酶”，将进入细胞的化疗药物泵出或使其外流，而维持细胞内化疗药物的低浓度水平，导致肿瘤细胞对化疗药物的多药耐药。P-gp不仅在肿瘤细胞膜上表达，人外周血淋巴细胞(如NK细胞、T细胞、B细胞等)如长期受某些化学药物的作用，其细胞膜上P-gp表达也会显著增加［4］。从而可以通过外周血淋巴细胞膜P-gp含量检测肿瘤耐药和寻找逆转肿瘤耐药药物。

以P-gp及其他耐药相关蛋白为作用靶点，筛选耐药相关蛋白逆转剂，找寻对耐药肿瘤细胞有效的凋亡诱导剂，对肿瘤治疗具有重要意义。体外实验发现，大剂量使用三苯氧胺可以获得足够浓度而能逆转P-gp/mdr1介导的MDR［5］。裸鼠实验研究亦表明，体内使用三苯氧胺能增强阿霉素的抑制肿瘤生长作用，即可以逆转其MDR表型，增加化疗敏感性［6］。三苯氧胺可部分逆转淋巴细胞mdr1表达阳性的非小细胞肺癌患者多药耐药性，显著提高EMP方案对耐药的非小细胞肺癌患者的疗效［1］。我们的实验表明，三苯氧胺能降低外周血淋巴细胞膜P-gp含量，提高外周血淋巴细胞膜P-gp转阴率，提高化疗总有效率，延长生存期，是一有效的耐药相关蛋白逆转剂。

相信随着人们对恶性肿瘤多药耐药机制及MDR逆转剂的研究，必将会找到更多的办法来克服肿瘤的耐药性，更好地指导临床化疗，减少盲目性，提高预见性，为肿瘤的综合治疗找到更多的办法。

［1］郭军，王宝成，尹格平.三苯氧胺对淋巴细胞mdrl表达阳性的非小细胞肺癌患者多药耐药性的逆转作用.临床肿瘤学杂志，1998，4(12)：19-22.

［2］BiedLer JL，Riehm H.Celluar resistance to actinomycin D in Chinese hemster cells in vitro：cross-resistance，radioautographic and cytogenetic studies.Cancer Res，1970，30(6)：1174-1184.

［3］穆宝忠，隋秀芳.肿瘤多药耐药基因p-糖蛋白及其耐药逆转的研究进展. 临床医药实践，2010，19(4)：245-246.

［4］Chau dary PM，Mech etner EB，Ronins on IB.Expression and activity of the multidrug resistance P-gly coprotein in human peripheral blood lymphocytes.Blood，1992，80(11)：2735-2739.

［5］沈历宗，吴文溪，武正炎.大肠癌多药耐药性研究进展.国外医学外科学分册，1998，25(4)：218-222.

［6］沈历宗，吴文溪.三苯氧胺逆转大肠癌多药耐药性的研究.中华实验外科杂志，2000，17(1)：65-66.