野菊内生真菌生物多样性与生态分布1)

卢东升 王明好 贾 晓

(信阳师范学院，信阳，464000)

野菊［Dendranthema indicum(L.)Des Moul.］为菊科多年生草本植物，其茎、叶、花均可人药，有清热解毒、消炎杀菌、凉血祛肿等功效，能治疗疔疮疖肿、乳腺炎、淋巴结结核、胃肠炎、高血压，亦可防治流感、流行性脑膜炎、肺炎、百日咳等。人们对野菊的药用成分及其功用已进行了系统研究，但关于野菊内生真菌的研究未见报道［1-2］。内生真菌对宿主植物生长、发育、生理代谢均具有重要影响［3］。为了解野菊花内生真菌的种类、分布特点，为内生真菌有益次生代谢物的研究与利用提供依据，笔者于2010年7月至9月在豫南地区选择了5个样地，通过标样采集，内生真菌的分离与鉴定，对此进行了初步研究。

1 材料与方法

培养基：马铃薯蔗糖琼脂培养基(PSA)：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1 000 mL，自然 pH值。倒平板时每100 mL培养基中加入5滴无菌的25%乳酸溶液，以抑制细菌生长;促孢培养基：KH2PO41 g，KNO31 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KC1 0.5 g，淀粉 0.2 g，葡萄糖 0.2 g，蔗糖 0.2 g，琼脂 15 g，水1 000 mL，pH值自然;水琼脂培养基：琼脂20 g，水1 000 mL，pH值自然。

标样采集：在河南省信阳市选取不同生境条件下的野菊样地5个(编号分别为 XX、XJH、XS、XHG、NW)。选健康野菊植株，采集没有腐烂发霉及病斑、病害的健康新鲜嫩枝、老枝、叶片、花蕾等器官适量，分别装入无菌纸塑料袋中，存于4℃冰箱保存备用。

内生真菌的分离与鉴定：叶、花蕾内生真菌的分离同文献［4］，茎内生真菌分离前，先用自来水将表面冲洗干净，晾干水分后切成3 cm长的茎段，分别用75%乙醇、2%次氯酸钠、75%乙醇消毒2、10、1 min，不同消毒剂消毒后均用无菌水冲洗3次，最后将茎段切成0.5 cm短段，老茎纵切成4等份。将茎段接入PSA平板，在28℃恒温箱内培养，组织块出现明显菌落时，依据菌落形态特点挑取不同真菌顶端菌丝转接PSA斜面，25℃恒温培养。将分离纯化后的真菌用不同基质的培养基诱导产孢，观察记录菌落、菌丝、产孢结构及孢子形态结构特征，参考有关专著［5-7］进行鉴定。

观测指标：统计内生真菌在野菊5种植物组织中的定殖率、分离率、多样性指数、相似性系数。计算方法按文献［8］。

2 结果与分析

2.1 野菊内生真菌的组成与分布

本研究共取野菊组织1 104块，经分离纯化得到内生真菌948株，其中770株能产生孢子，依据其形态特征鉴定为15属21种，它们绝大多数属半知菌，极少数为子囊菌。另有178株(18.3%)经诱导未产生孢子，为非产孢菌株。产孢真菌的分离率及分布见表1，可知，刺盘孢菌(Colletotrichum spp.)、拟茎点霉(Phomopsis spp.)、大茎点霉(Macrophoma sp.)3个属真菌在各个样地的野菊各器官均有分布，分离率高达40.7%～60.4%，是野菊优势内生真菌。另外，茎、叶和花器官均有专化的内生真菌栖息，说明内生真菌分布具有明显的组织专一性。

2.2 野菊内生真菌定殖率

内生真菌在各样地野菊各器官均可定殖，且定殖率较高，总体达79.2%～99.3%，但不同样地野菊内生真菌定殖率存在明显差异。按定殖率大小排列依次为：XS(99.3%)＞XX(84.9%)＞NW(83.6%)＞XJH(82.5%)＞XHG(79.2%)。从组织水平上看，内生真菌在老枝定殖率最高(95.8%)，其次为叶片(92.0%)，花蕾的定殖率最低(77.8%)。由实验结果可知，内生真菌在野菊花体内的定殖与植物体生存的外部环境有关，也与其器官组织结构、生化条件等内部微生态环境密切相关。处于阴地湿度较大环境条件下的野菊花，内生真菌定殖率较高，反之，在光照强度大且较干燥的环境内，其内生真菌定殖率较低。菊花内生真菌的定殖率与器官组织的嫩度成反比，嫩度愈大，定殖率愈低，嫩度越小，定殖率越高。

2.3 野菊内生真菌的多样性与相似性

供试的野菊5个样地，其内生真菌的多样性指数不同，从高 到低的顺序为XX(2.17)、XJH(1.88)、XS(1.68)、XHG(1.65)、NW(1.46);在供试的 5 种器官中，其内生真菌的多样性指数较接近，但也有不同，从高到低排列为花蕾(1.48)、叶柄(1.35)、叶片(1.33)、老茎(1.23)、嫩茎(1.13)(表2)。以上数据说明野菊花生存外部的环境对内生真菌的多样性有明显影响。样地XX、XJH野菊花均生于林下，生境阴闭且湿度大，为不同真菌在植物体内的栖息提供了较好的环境条件，而样地NW野菊花生于向阳的山坡杂草丛，生境较干燥，不利于内生真菌的定殖。不同样地之间，野菊花内生真菌种类组成的相似性系数在0.375～0.875范围内，其中样地XHG与XX之间相似性系数最高(0.875)，而样地XS与NW之间相似性系数最低(0.375);样地XS、XHG、XJH之间的相似性系数较高(0.778～0.857)，但样地 NW 与 XJH、XS、XHG 之间内生真菌的相似性系数较低(0.375～0.462)(表3)。这说明不同样地野菊生存外部的环境对内生真菌种类组成的相似性系数也有明显影响。样地XS和NW环境差异较大，一个为向阳山坡而另一个为背阴山坡，它们之间野菊花内生真菌的相似数最低。

表1 野菊内生真菌分离率及分布

表2 野菊内生真菌定殖率及多样性指数

表3 不同样地野菊内生真菌相似系数

3 讨论

研究结果说明野菊内生真菌物种丰富，分布普遍，它们多数为半知菌，少数为子囊菌。其中，刺盘孢菌(Colletotrichum spp.)、拟茎点霉(Phomopsis spp.)、大茎点霉(Macrophoma sp.)3个属真菌分离率高，且分布广泛，是野菊优势内生真菌。内生真菌在供试的野菊各器官均有定殖，且定殖率较高，总体达79.2%～99.3%。环境条件是影响内生真菌群落结构及真菌多样性的主要因素，宿主组织类型对内生真菌的群落结构也有重要影响。菊科植物内生真菌及生态功能已有研究。曹益鸣等对茅苍术内生真菌生物多样性及生态分布进行了研究［9］。茅苍术和野菊内生真菌比较，二者均具有丰富的内生真菌生物多样性和明显的组织专一性，但内生真菌群落结构存在明显差异，特别是优势真菌种类完全不同。茅苍术内生真菌优势种为镰孢菌(Fusarium sp.)、青霉菌(Penicillium sp.)、丝核菌菌(Rhizoctonia sp.) 和多腔菌菌(Myriangium sp.)，而野菊内生真菌优势种为刺盘孢菌(Colletotrichum spp.)、拟茎点霉(Phomopsis spp.)、大茎点霉(Macrophoma sp.)。这说明同一科植物，物种不同其内生真菌群落结构及优势种也不同;宋文玲等对菊花(Chrysanthemum morifolium)内生真菌的生态功能进行了研究，结果发现，内生真菌葡萄孢

(Botrytis sp.)和毛壳菌(Chaetomium globosum)与菊花建立共生关系后，可以提高菊花产量和品质［10-11］。野菊内生真菌与菊花内生真菌的生态功能是否相同，有待深入研究。另外，据报道，野菊可以产生黄酮类次级代谢产物，具有抗氧化、抗病毒、抗基因诱变、抑菌消炎等多种药理作用。野菊花内生真菌是否产生具以上功能的黄酮类次级代谢物，需要进一步试验分析。

［1］朱庆书，赵文英.超声提取野菊花总黄酮及其抑菌活性的研究［J］.化学与生物工程，2008，25(12)：72-74.

［2］Chang K M，Choi EM，Kimg H.Chemical constituentsof Chrysanthemum indicum L.flower oil and effect on osteoblastic MC3T3-E1 cells［J］.Food Science and Biotechnology，2010，19(3)：815-819.

［3］石瑛.内生真菌对植物生长发育的影响［J］.现代农业科技，2010(6)：36-38.

［4］卢东升，王金平，吴小芹，等.茶树内生真菌的种类及分布［J］.河南农业科学，2007(10)：54-80.

［5］魏景超.真菌鉴定手册［M］.上海：上海科学技术出版社，1979.

［6］戴芳澜.真菌的形态和分类［M］.北京：科学出版社，1987.

［7］邵力平，沈瑞祥，张素轩.真菌分类学［M］.北京：中国林业出版社，1984：1-346.

［8］孙剑秋，郭良栋，臧威，等.药用植物内生真菌多样性及生态分布［J］.中国科学 C 辑：生命科学，2008，38(5)：475-484.

［9］曹益鸣，陶金华，江曙，等.茅苍术内生真菌生物多样性与生态分布研究［J］.南京中医药大学学报，2010，26(2)：137-139.

［10］宋文玲，戴传超，姜宝娟，等.促进菊花苗期生长的内生真菌筛选与鉴定研究［J］.江苏农业科学，2009(1)：149-152.

［11］宋文玲，戴传超，刘晓珍，等.不同内生真菌对菊花产量和品质的影响［J］.中药材，2010，33(1)：4-7.