大鳞副泥鳅(2n♀)×泥鳅(4n♂)杂种后代染色体带型及FISH分析

贾光风，李雅娟，钱 聪，高 敏

（1.大连市甘井子区农林水利和海洋渔业局中国海监甘井子区大队，辽宁 大连 116033；2.大连海洋大学生命科学与技术学院，辽宁 大连 116023）

泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）和大鳞副泥鳅（Pararnisgurn dabryanus）是我国常见的小型经济鱼类。近几年来，随着市场经济的发展和出口量的不断增加，再加上自然水域环境受到人为的破坏，生产量逐年下降，很难满足市场的需求。目前养殖规模逐年扩大，已经成为目前主要的养殖品种。因此，良种的选育就显得十分重要。人工诱导三倍体鱼类以其育性差、生长快等特性而成为鱼类遗传育种研究的热点。但人工诱导三倍体等方法存在产量低、不稳定和难操作的特点，无法满足产业化的要求。四倍体被认为是三倍体产业化发展的关键，因为利用四倍体与二倍体杂交理论上可以产生100%的三倍体。目前，有关大鳞副泥鳅和泥鳅杂交的受精细胞学、染色体变化及遗传分析已有报道[1-3]，但关于杂交后代分子细胞遗传学方面的研究未见报道。因此，本文通过对二倍体大鳞副泥鳅和四倍体泥鳅的杂交后代的染色体进行Ag-NORs、CMA3/DA/DAPI及FISH等系列分析，旨在为杂交后代提供直接的三倍体细胞遗传学证据，也为大规模生产全三倍体泥鳅提供有效途径。

1 材料和方法

1.1 亲鱼的采集

泥鳅（4n）来自湖北省洪湖市,大鳞副泥鳅和泥鳅（2n）来自大连农贸市场。其倍性经血红细胞核体积测量、流式细胞仪检测确定。实验室水族箱暂养，暂养温度为（25±1）℃。

1.2 人工催产及授精

挑选性腺发育良好的泥鳅（2n和4n）和大鳞副泥鳅（2n）注射绒毛膜促性腺激素（HCG）（注射剂量：♀20-25 IU·g-1，♂减半），12 h后轻压大鳞副泥鳅（2n）及泥鳅（2n）腹部即有卵排出，分别收集于不同的9 cm培养皿中，泥鳅（2n、4n）按生殖孔下边两侧，用毛细管分别收集精液于塑料离心管中（用淡水生理盐水稀释100倍），干法授精。试验分为2组，即杂交组大鳞副泥鳅×泥鳅（2n×4n）和对照组泥鳅×泥鳅（2n×2n）。应该有大鳞副泥鳅（2n×2n）与泥鳅（4n×4n）作为双对照，否则和以证明三倍体的带型介于二倍体和四倍体之间。

1.3 幼鱼培育

孵化和幼鱼培育的温度为（25±1）℃。经常更换曝气的水，保持室内空气新鲜和流通。及时用吸管吸出死亡的胚胎。

1.4 染色体标本制备

取发育眼胞期的胚胎30～50个，用镊子去卵膜和卵黄放入盛有0.0025%的秋水仙素中处理45 min，0.8%的柠檬酸低渗20 min，卡诺固定液（甲醇∶冰醋酸=3∶1）固定，冷冻过夜。冷滴片，镜检。-80℃冰箱冷冻保存。

1.5 银染（Ag-NOR）

参照Howell and Black的快速银染法进行[4]。50%硝酸银与2%明胶（内含1%甲酸）以2∶1混匀后滴在染色体标本上，加盖片后，于70℃温箱内处理2 min。当整张玻片呈棕黄色时取出，流水冲去盖片，干燥后镜检。

1.6 CMA3/DA/DAPI三重荧光染色

参照Schweizer和Schweizer的方法[5-6]，略有改动。0.5 mg·mL-1Chromomycin A3（CMA3）染色 40 min，MacIlvaine buffer（MI，pH 7）漂洗 2 次，0.1 mg·mL-1Distamycin A（DA）染色15 min，MI缓冲液漂洗 2 次，0.5 μg·mL-14,6-diamidino-2-phenylindole（DAPI）染色15 min,MI缓冲液漂洗2次,甘油和MI缓冲液1∶1封片，荧光显微镜下观察拍照。

1.7 染色体荧光原位杂交（FISH）

本试验采用Fujiwara的荧光原位杂交（FISH）技术方法并稍加修改[7]。

从-80℃冰箱中取出染色体标本，放入65℃恒温箱干燥2 h。染色体标本放入70℃的70%甲酰胺/2XSSC（pH 7.0）溶液中处理2 min，迅速移入-20℃预冷的装有70%酒精的染色缸内脱水10 min，再移入100%的-20℃预冷酒精内脱水5 min，空气干燥。把人的5.8S+28SrDNA探针用生物素（Biotin-11-dUTP）进行标记。标记后的探针用酒精进行纯化，100%脱离子甲酰胺溶解，75℃处理10 min，迅速移到冰水中。变性后的探针加入杂交混合液中，混匀后取40 μL滴到变性后的染色体标本上，覆上封口膜后放入37℃恒温箱中杂交一个晚上。轻轻揭掉封口膜，染色体标本放入500%甲酰胺/2×SSC溶液42℃漂洗20 min，2×SSC室温漂洗20 min，1×SSC室温漂洗20 min，4×SSC室温漂洗5 min。加入100 μL 10 μg·mL-1的avidin-FITC，盖上封口膜，放在2×SSC湿盒中，37℃培养箱避光温育1 h。轻轻揭掉封口膜，放在Triton/4×SSC溶液中避光漂洗20 min，4×SSC溶液避光漂洗5min，新的4×SSC溶液避光漂洗5 min。在有染色体范 围 内 滴 入 100 μL 10 μg·mL-1的 biotin/antiavidin，盖上新的封口膜，放在2×SSC湿盒中，37℃培养箱避光温育1 h，漂洗同上。滴入50 μL 2.5 μg·mL-1的DAPI/antifade溶液，用指甲油封片，平放在载玻片夹中冷藏。用Olympus AH2荧光显微镜观察杂交信号，Spot Cooled CCD装置捕获图像,利用Spot和Photoshop软件进行图像处理。

2 结果与分析

2.1 Ag-NORs

在对照组2n×2n杂交后代间期核中最高银染点数为2个（见彩版Ⅰ-A），杂交组2n×4n杂种后代间期核中最高银染点数为3个（见彩版1-B）；对照组2n×2n杂交后代有丝分裂中期分裂相中最高银染点数为2个（见彩版Ⅱ-A），杂交组2n×4n杂种后代有丝分裂中期分裂相中最高银染点数为3个（见彩版Ⅱ-B）。由此我们认为二倍体大鳞副泥鳅与四倍体泥鳅杂交产生的后代具有3个NORs，即为三倍体。

2.2 CMA3/DA/DAPI三重荧光染色

对照组2n×2n和杂交组2n×4n杂种后代中期染色体CMA3/DA/DAPI研究结果如彩版Ⅲ所示。当用B激发（蓝光λ＝440～480 nm），对照组2n×2n杂交后代有丝分裂中期分裂相中，2个中部着丝粒染色体（M）的端部区域显示有明亮的CMA3阳性部位（见彩版Ⅲ-A）；杂交组2n×4n杂种后代有丝分裂中期分裂相中，3个中部着丝粒染色体（M）的端部区域显示有明亮的CMA3阳性部位（见彩版Ⅲ-B）。该结果与Ag-NORs位置相同，为核仁组织区（NORs）。

2.3 5.8S+28SrDNA的染色体定位

用生物素标记的5.8S+28SrDNA分别与对照组2n×2n和杂交组2n×4n杂交后代的有丝分裂中期染色体进行原位杂交。如彩版Ⅳ所示，5.8S+28SrDNA基因的荧光原位杂交结果显示在对照组2n×2n杂交后代有丝分裂中期分裂相中两个主要的荧光信号清晰地定位于中部着丝粒染色体短臂的端部区域（见彩版Ⅳ-A），杂交组2n×4n杂交后代有丝分裂中期分裂相中三个主要的荧光信号清晰地定位于中部着丝粒染色体短臂的端部区域（见彩版Ⅳ-B）。该结果与上述银染及CMA3位置相同，表明二倍体大鳞副泥鳅与四倍体泥鳅杂交后代是三倍体。

3 讨论与结论

硝酸银特异地染色NORs结合的酸性蛋白,使该区域呈黑色。Ag2NORs法被广泛地应用于鱼类染色体研究中，获得了可靠的结果，并以此作为研究物种间的亲缘关系和染色体进化的一个指标[8]。Ag-NORs可以准确显示染色体上rDNA的位置，这已为原位分子杂交所证实[9-10]。本试验对早期胚胎间期核进行Ag-NORs染色，结果表明，在2n×2n胚胎细胞核中最高银染点数为2个，2n×4n胚胎中细胞核中最高银染点数为3个。在多倍体鱼类的倍性鉴定中，银染核仁组织区法与其他多倍体鱼类的倍性检测方法相比，不但快捷准确而且省时省力，无需特殊的仪器，在条件相当简陋的实验室就可以进行操作，是值得推广的一种好方法。

CMA3与DAPI均为荧光染料，CMA3染色可以特异性地显示一些生物的核仁组织区（NORs）及其他某些GC丰富区，DAPI则于染色体上的AT富含区专一性结合。因而，只要存在NORs就可用CMA3染色显示出来。CMA3染色强度与NORs处的GC含量呈正相关[8]。目前为止,CMA3染色研究以见于植物、鱼类、两栖类、爬行类、鸟类等多种生物，在所有这些生物类群中，NORs呈现明显的荧光（CMA3阳性）。因此，CMA3染色为生物NORs的识别鉴定提供了另一快速、简便的手段[11]。本研究结果表明，2n×2n杂交后代有丝分裂中期分裂相中，中部着丝粒染色体（M）的端部区域显示有2个明亮的CMA3阳性部位；2n×4n杂交后代有丝分裂中期分裂相中，中部着丝粒染色体（M）的端部区域显示有3个明亮的CMA3阳性部位。与Ag-NORs位置相同，说明2n×4n杂交后代具有3套染色体组，是三倍体。

rDNA为高度串接重复序列，其编码区的保守性和非编码区的多态性是研究动植物系统发育与进化的一个有用标记[12]。rDNA在染色体上分布的数目和具体定位可作为标记来识别染色体以及分析多倍体物种的进化过程[13]，同时rDNA在染色体上的定位可以对传统核型的分析进行校正，尤其对于染色体较小且形态特征不明显的材料，可以提高同源染色体配对的准确性。本研究将人的5.8S+28SrDNA清晰地定位于二倍体大鳞副泥鳅和四倍体泥鳅杂交后代的染色体上。2n×2n中两个主要的荧光信号清晰地定位于中部着丝粒染色体短臂的端部区域，2n×4n中三个主要的荧光信号清晰地定位于中部着丝粒染色体短臂的端部区域。

Sola以18SrDNA为探针对杜氏鰤鱼（Seriola dumerili）进行了FISH分析[14]，得到的结果与通过银染和CMA3染色得到的NORs位点相吻合,而且NORs所有的顺反子（Cistrons）都是有活性的。Rossi分别对鲻（Mugil cwphalus）和薄唇梭（Liza ramada）做了类似的研究[15-16]，也得到了类似的结果。Li以人的5.8+18SrDNA为探针对二倍体和四倍体泥鳅进行了FISH分析[17]，得到的结果与通过银染和CMA3染色得到的NORs位点相吻合。但是Pendas在对鲑（Salmosalar）的研究中却发现Ag-NORs位点与FISH信号并不完全重叠[18]，他们的结果表明，鲑的Ag-NORs位点只局限在次缢痕位置，而FISH信号却散布在NORs所在的整个染色体臂上。本研究Ag-NORs、CMA3/DA/DAPI及5.8S+28S rDNA的FISH定位在2n×4n杂交后代染色体上的位置相同，均位于中部着丝粒染色体（M）的端部区域，即核仁组织区域（NORs）。该结果为杂交后代提供了直接的三倍体细胞遗传学证据，也为大规模生产全三倍体泥鳅提供有效途径。

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