小鼠附睾分泌蛋白Fam12b的原核表达与纯化

陈立瑾，田利源，李秀丽，汪 莉，王玉民，陈树林

（1.西北农林科技大学动物医学院，陕西 杨凌 712100；2.军事医学科学院 生物工程研究所，北京 海淀 100071）

附睾是连接睾丸和输精管的细长管道，哺乳动物的精子在睾丸中生成后，并没有达到功能上的成熟。在穿过附睾时，与附睾中的液体相互作用，才逐步获得授精的能力［1-3］。附睾基因功能的研究已经成为生殖生物学的一个热点。

本文研究的fam12b基因属于小鼠附睾基因，在小鼠出生后不久即有表达，且可以分泌到附睾腔中［4］。近来的研究将fam12b归为RNase A超家族的新成员［5-6］。大部分RNase A基因在大鼠、小鼠和人中含有同源基因［7］，RNase A超家族成员具有多种生物学功能：可以降解核酸、抗菌、抗病毒［8］、抑制肿瘤生成［9］、参与哺乳动物内源宿主防御［10-11］等。fam12b基因在小鼠附睾中高表达［4］，我们推测它可能参与了精子成熟的过程。目前还未见研究报道Fam12b蛋白的功能。

本试验中我们克隆了小鼠附睾基因fam12b，串联后连入pET28（a）载体，于大肠杆菌 Rosetta（DE3）中诱导表达，获得高纯度融合蛋白，为进一步研究Fam12b的功能创造了条件。

1 材料与方法

1.1 材料 8周龄C57雄鼠由北京军事医学科学院实验动物中心提供。

表达载体pET28（a）由国家仪器分析中心张学敏实验室惠赠；大肠杆菌 DH5α、Rosetta（DE3），购自北京全式金生物技术有限公司。

试剂：动物组织总RNA提取试剂盒、普通DNA产物纯化试剂盒，均购自北京天根生物科技有限公司；限制性内切酶Nde I、EcoRⅠ、HindⅢ、EcoR V、T4DNA连接酶，购自NEB生物公司；Ni-NTA亲和柱，购自Qiagen公司；PCR引物合成及测序均由北京奥科生物技术有限责任公司完成。

1.2 目的基因fam12b的获得 提取8周龄C57雄鼠附睾总RNA，反转录获得相应的cDNA。参照GenBank公布的序列（NM＿203508.1），用信号肽分析软件（http：／／bmbpcu36.leeds.ac.uk／prot-analysis／signal）分析出信号肽序列，将去掉信号肽的序列扩增出来。扩增目的基因的两种片段1和2，在片段1的5端引入NdeⅠ酶切位点，在3端引入Eco RⅠ酶切位点；在片段2的5端引入Eco RⅠ酶切位点，3端引入Hin dⅢ酶切位点。其中片段1不含终止密码子，片段2含有终止密码子。

设计引物如下（下划线为酶切位点）：

1.3 表达载体的构建及鉴定 片段1用NdeⅠ和Eco RⅠ双酶切，片段2用Eco RⅠ和Hin dⅢ双酶切，原核表达载体pET28（a）用Hin dⅢ、NdeⅠ双酶切，产物用T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。用Hin dⅢ和Eco R V双酶切鉴定重组质粒，酶切正确的质粒由北京奥科生物技术有限责任公司测序。

1.4 融合蛋白的诱导表达 将测序正确的重组载体转化至大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞，37℃、200r／min振荡培养过夜。次日转接至新的液体培养基，振荡培养至OD600nm为0.6，加入终浓度为1mmol／L的IPTG，37℃诱导4h。收集1mL菌液，离心去上清加入溴酚蓝缓冲液悬浮沉淀，处理后进行SDS-PAGE检验。

1.5 Western-blot鉴定目的蛋白 将1.4中菌体裂解液进行SDS-PAGE，转移至0.22μm的PVDF膜上，用封闭液室温封闭1h，以His标签抗体孵育1h，TBST洗涤，羊抗鼠IgG-HRP孵育1h，TBST洗涤，加入HRP化学发光检测底物后在暗室显影。

1.6 纯化融合蛋白［12］将诱导成功的阳性菌液转接至新的液体培养液中，37℃、200r／min振荡培养至OD600nm为0.6，加入IPTG诱导，振荡培养4h。离心收集菌体细胞，-20℃冻存。IPTG诱导前后的菌液各取1mL，SDS-PAGE检测目的蛋白的表达。

取出冻存的菌体，按照QIAGEN蛋白纯化试剂盒说明书进行纯化，向10mL变性蛋白缓冲液B（pH值8.0）中加入500μL蛋白酶抑制剂溶液，混匀后加至菌体沉淀，室温放置1h。然后离心取上清加至Ni-NTA蛋白纯化柱，用变性蛋白缓冲液C（pH值6.3）洗涤2次后用变性蛋白缓冲液E（pH值4.5）洗脱3次。收集各步骤中流出的液体，SDS-PAGE检验。

2 结果

2.1 目的基因的克隆 经1%琼脂糖凝胶电泳，PCR扩增产物约在380bp处有特异性条带，与预期相符（图1）。

图1 fam12b基因的PCR扩增结果

2.2 重组载体的鉴定 构建的重组质粒经Hin dⅢ、Eco R V双酶切鉴定，预期片段大小分别为2126bp与3969bp的片段，试验结果与预期相符（图2）。测序后显示成功获得序列完整且读码框正确的表达载体。

2.3 融合蛋白的诱导表达及鉴定 将1.4中处理的样品进行SDS-PAGE分析，在约31kDa处检测到蛋白表达的条带。Western-blot鉴定显示出在该位置处有特异性条带（图3）。

2.4 融合蛋白的亲和纯化 重组蛋白带有His标签，用Ni-NTA蛋白纯化柱亲和纯化，收集各步骤中的液体，进行SDS-PAGE电泳检测，如图4。

3 讨论

雄性哺乳动物的生殖道不容易被感染，很重要的一个原因是附睾上皮细胞会分泌一些蛋白，其中有些蛋白具有抗菌作用，保护精子可以顺利通过生殖道［13］，精子在穿过附睾的过程中逐步成熟［14］。我们前期的工作用fam12b的单个基因连入pET28（a）载体，摸索了不同梯度的诱导剂浓度和诱导温度，但是均未检测到目的蛋白的表达；只有当两个相同的基因串联后，才能以融合蛋白的形式表达出来，我们推测该蛋白可能具有一定的抗菌能力，两个基因串联表达后，改变了天然存在蛋白的空间构象，进而干扰了蛋白的抗菌能力，故可以在大肠杆菌Rosetta中表达出来。另外，小分子蛋白的免疫原性较小，采用串联表达的方式可以增加该蛋白的免疫原性，便于制备抗体用于后续试验研究。

4 结语

本试验利用原核表达体系表达了小鼠附睾分泌蛋白Fam12b的融合蛋白，并获得纯度较好的蛋白，为制备其多克隆抗体奠定了基础，为进一步研究Fam12b的功能创造了条件。

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