自拟中药口服液对大肠杆菌O78的体外抑制试验

高光平,张艳英,高桂生,汤生玲,史秋梅,梁银聚,邵欣华

(1.河北科技师范学院动物科技学院河北省预防兽医学重点实验室,河北 昌黎 066600;2.河北新华科极兽药有限公司,河北 石家庄 051430)

大肠杆菌是禽类常见的肠道条件致病菌。中草药在我国资源丰富,价格低廉,相对于抗生素和化学合成药物而言,含有多种药效成分,具有多靶点、毒性较低、不易产生耐药性等特点,在防病治病的同时,还具有促进动物生长、增强机体免疫力、提高整体抗病能力等作用,且使用后也不会影响禽产品的食用安全性与食用品质,符合当今社会倡导的绿色养殖主题,有着广阔的发展前景。

近年来,有关中药抗大肠杆菌病的作用研究有许多报道[1-2]。但是应用药物敏感性试验和最小抑菌浓度两种方法综合评价中药口服液对大肠杆菌的体外抑制作用较少见于报道。本次试验通过药物的敏感性和最小抑菌浓度对中药口服液体外抑制大肠杆菌O78的效果进行了初步的探究,二者综合判断其抑菌效果,为临床用药打下基础。

1 材料与方法

1.1 菌种 鸡源性大肠杆菌标准菌种(O78)购自中国兽医药品监察所。

1.2 药品 大青止泻口服液:由大青叶、黄柏、乌梅、诃子组成;白头翁口服液:由白头翁、黄连、大黄、甘草组成;双连固肠口服液:由金银花、穿心莲、黄芪、秦皮组成。以上中药均购自昌黎县民生药店。药敏纸片购自北京天坛生物药物技术开发公司:头孢他啶(30μg,0903061),头孢吡肟(30 μg,0908221),头孢曲松(30μg,0811261),头孢噻肟(30μg,0812171),丁胺卡那霉素(30μg,0902201),氟哌酸(10μg,0903181),环丙沙星(5μg,0902271),庆大霉素(10 μg,0902181),克林霉素(2 μg,0902251)。

1.3 试剂 营养琼脂,国药集团化学试剂有限公司(0906251);营养肉汤,国药集团化学试剂有限公司(0901061)。

1.4 试验仪器 高压蒸汽灭菌锅、中药煎药机、恒温培养箱、超净工作台、旋转蒸发器等。

1.5 中药口服液的制备 将3种方剂的中药分别混匀后,装入无纺布袋,清水浸泡30 min,加热煮沸30 min,过滤,药渣再加清水煮沸20 min,过滤,合并二次滤液后浓缩至生药含量1 g/m L,121℃灭菌20 min,4℃冰箱中保存备用。

1.6 菌种准备 将试验菌种接种于普通营养琼脂平板,37℃培养18 h,然后挑取普通营养琼脂平板上的纯培养典型菌落于3 m L生理盐水中,混匀后与菌液比浊管比浊,调整浊度与比浊管(0.5麦氏单位)相同。

1.7 药物敏感性试验

1.7.1 打孔法 于无菌平皿内加入约25 m L营养琼脂,凝固后用无菌棉拭子蘸取已配制好的细菌混悬液涂布整个营养琼脂表面。用直径为0.6 cm的无菌打孔器在培养基上打孔,在孔内加入1 g/mL生药的口服液,以加满而不溢出孔外为宜。每种药液做3个平皿,置于37℃恒温培养箱中培养24 h,测量抑菌圈直径。判定标准:抑菌圈直径＜8 mm,为不敏感,记为(-);抑菌圈直径8～13 mm之间,为低度敏感,记为(+);抑菌圈直径在13～19 mm之间,为中度敏感,记为(++);抑菌圈直径在＞19 mm,为高度敏感,记为(+++)[3]。

1.7.2 K-B纸片法 于无菌平皿内加入约25 mL营养琼脂,凝固后用无菌棉拭子蘸取已配制好的细菌混悬液涂布整个营养琼脂表面取药敏纸片贴在平板表面,置37℃恒温培养箱中培养24 h,测量抑菌圈的直径。判定标准采用美国临床实验室标准委员会(NCCLS)推荐的判断标准表示[4]。

1.8 药物的最小抑菌浓度(MIC)试验 管碟法:取13×100 mm灭菌试管11支,编号,每管加入无菌肉汤培养基2 m L,然后于第1管中加入受试中药口服液2 m L,混匀后取出2 m L加入第2管中,以此类推,直到第9管中取出2 m L弃去,第10管不加药液作阳性对照,第11管加入受试药液2 mL,混匀后取2 mL弃去,不加细菌作阴性对照。将培养8 h的试验菌液,用无菌肉汤稀释成原溶液的10-3倍浓度,分别取 0.1 mL加入上述1～10号试管中[5]。从上述11个试管中分别取1 m L液体加入11个灭菌的平皿中,将灭菌处理的冷却至40℃的营养琼脂分别倒入上述11个平皿中,晃动平皿使之混合均匀,琼脂凝固后放入37℃恒温培养箱中培养24 h,观察平皿中菌落数量,试验重复3次,以无菌落生长平板的最低药物浓度为最小抑菌浓度(minimum inhibiting concentrations,MIC)[6-7]。

2 结果与分析

2.1 药物敏感性试验结果 大青止泻口服液、白头翁口服液、双连固肠口服液对大肠杆菌O78均有较好的抑制作用,其中大青止泻口服液抑菌效果最强;白头翁口服抑菌效果较弱;西药对照组中,大肠杆菌O78对丁胺卡那霉素、氟哌酸、头孢类抗生素高度敏感;对环丙沙星、庆大霉素、克林霉素耐药。药敏试验结果见表1。

2.2 药物MIC试验结果 大青止泻口服液的MIC为0.031 g/mL(1∶32),白头翁口服液的MIC为0.25 g/mL(1∶4),双连固肠口服液的 MIC为0.063 g/mL(1∶16)。药物MIC测定结果见表2。

表1 药物敏感性试验结果

表2 药物MIC测定结果

3 讨论

在测定MIC时,本试验采用了管碟法。由于中草药是有颜色的,因此,本试验中所设阴性对照并非常规的培养基对照而是含有药液的培养基,并且采用琼脂平板计数,以消除上述不利因素,确保了结果判定的准确性。刘玉庆等在测定MIC时,采用了平板稀释法[2],简化了试验操作,但这种方法不能最大限度提高中药浓度,对于高MIC中药测定不利;管碟法结合了试管法浓度高、准确性好及平板法显示稳定的优点,比较适合中药MIC的测定。Seishi Matsumura等在测定黄芩对致龋细菌的最小抑菌浓度时,也同样采用了管碟法,效果良好[8]。

4 结语

4.1 药物敏感性试验表明,自拟的大青止泻口服液、白头翁口服液、双连固肠口服液对大肠杆菌O78均具有较好的抑菌作用,且大青止泻口服液和双连固肠口服液的抑菌效果较白头翁口服液好。自拟的口服液虽然比头孢菌素类的抑菌效果弱,但是比庆大霉素、克林霉素、环丙沙星的抑菌效果好。

4.2 3种方剂的MIC试验结果表明,大肠杆菌O78对大青止泻口服液和双连固肠口服液更敏感,大青止泻口服液的最小抑菌浓度是0.031 g/m L,白头翁口服液和双连固肠口服液的最小抑菌浓度分别是0.25 g/m L,0.063 g/m L。

3种方剂的药物敏感性结果与MIC试验结果一致。综上所述,3种方剂对大肠杆菌O78均有较好的体外抑制作用,其中大青止泻口服液效果最佳,双连固肠口服液次之。

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