花椰菜细胞质雄性不育系的细胞学研究

朱惠霞 陶兴林 胡立敏

（甘肃省农业科学院蔬菜研究所，甘肃兰州 730070）

有关十字花科细胞质雄性不育的细胞学研究，目前已在油菜、白菜、萝卜上有深入的报道（余凤群和傅廷栋，1990；谢潮添 等，2004；聂明建 等，2007；刘静 等，2008；田如霞 等，2010），研究认为败育方式主要有无花粉囊型、花粉母细胞败育型和单核花粉败育型3种，而败育的时期从造孢细胞到三核花粉的各个时期均可发生。本试验的花椰菜（Brassica oleraceaL. var.botrytisL.）细胞质雄性不育系09-R9，是以从北京华耐公司引进的白灵作为母本，与甘肃省农业科学院蔬菜研究所花椰菜课题组原有自交系24进行回交转育，到2009年已转育6代，不育性遗传稳定，不育株率100%，不育度100%。通过对该不育系花药发育细胞学形态进行观察，并与其他十字花科细胞质不育材料进行比较，分析不育系09-R9的花药败育时期和发育特点，为探索花椰菜细胞质雄性不育机理提供基础资料，为今后将该不育系应用于生产实践提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为花椰菜细胞质雄性不育材料 09-R9及其相应的可育材料 24，2008年 11月 25日播种育苗，2009年3月17日定植于本所塑料大棚，每品种1小区，不设重复，常规管理。石蜡切片、显微观察等在本所实验室内进行。

1.2 方法

2009年7月5日取样，采摘可育株及不育株主花序上不同大小花蕾，用游标卡尺测量长度，参考杨光圣等（1999）对正常油菜的花药发育划分方法，取不同长度花蕾的正常花药镜检确定发育时期。将其分为孢原细胞时期、造孢细胞时期、花粉母细胞减数分裂至四分体时期、单核花粉期、花粉成熟期。

将不同发育时期的花蕾分别用卡诺液（无水乙醇∶冰醋=3V∶1V）固定24 h后，用梯度酒精（70%、80%、90%、95%、100%）脱水，梯度二甲苯（2/3纯酒精+1/3二甲苯、1/2纯酒精+1/2二甲苯、1/3纯酒精+2/3二甲苯、二甲苯）透明，按常规切片程序包埋，旋转式切片机切片，切片厚度为5μm，铁矾-苏木精染色，加拿大树胶封藏，OLYMPUS显微镜观察并照相。

2 结果与分析

2.1 花椰菜可育株花药发育的细胞学观察

在花椰菜可育株雄蕊发育过程中，花药的横切面呈蝶型，有发育正常的4个花粉囊。当花蕾长约1.0 mm时，花药的4个角隅处已形成清晰的药室，药室壁层染色较深（图Ⅰ-1），药室放大后可以看出，花粉母细胞的体积较大，呈多边形，细胞核大，染色深（图Ⅰ-2）。随着发育进程的推进，花粉母细胞渐近圆形，并进行减数分裂，产生的四分体被一层胼胝质包围（图Ⅰ-3、4），此后胼胝质开始解体，四分孢子从中释放出来，刚分离出来的小孢子外形不规则，但很快变成圆形或近圆形，成为单核花粉粒，在此发育过程中，绒毡层细胞逐渐向内收缩，在即将成熟的花药中，绒毡层逐步解体，位于花药隔同一侧的相邻的2个囊逐渐靠近（图Ⅰ-5），形成成熟花粉粒，花粉粒染色很深（图Ⅰ-6）。开花前，组成花药壁的细胞只剩花药表皮和纤维层两层，这2个囊将打通成1个共同的药室将花粉散放出来。

图版Ⅰ 正常花椰菜花药发育过程

2.2 花椰菜不育株花药发育的细胞学观察

对花椰菜细胞质雄性不育系09-R9花药的细胞学观察结果表明，在花蕾长1.0 mm时，花药的形状很不规则，大小各不相同，有的花药形成4个外形正常的花粉囊（图Ⅱ-1），有的形成1个或2个花粉囊，其他位置始终保持薄壁状态，未分化出花粉囊。与同时期的可育花药相比，明显发现不育花药的药室内并未形成正常的花粉母细胞，且花粉囊壁染色较深，结构异常（图Ⅱ-2）。在应该发育到四分体时期时，花粉囊逐渐变形，囊壁变薄，囊内物质解体（图Ⅱ-3、4），到花粉粒成熟前，花粉囊也逐步解体（图Ⅱ-5），至开花前已经完全解体，子房膨大，只留下一部分残壁染色较深、干瘪的花药（图Ⅱ-6），且相邻两花粉囊的药隔组织消失。

图版Ⅱ 花椰菜细胞质雄性不育系09-R9花药败育过程

3 讨论

本试验所用的细胞质雄性不育材料，花药会形成部分外形正常花粉囊，但花粉母细胞解体，且囊内的物质随着花药的发育逐渐解体，最终所有的花粉囊也都解体，直至溶解消失，这一结果与田如霞等（2010）研究的春萝卜雄性不育系败育的结果十分相似，即花粉囊最终降解消失，只留下干瘪的花药，但二者败育的时期并不相同，春萝卜的败育发生在单核靠边期，而本试验所用的花椰菜细胞质雄性不育系09-R9败育发生在花粉母细胞时期，这与聂明建等（2007）研究的甘蓝型油菜细胞质雄性不育系392A的败育时期和方式一致。本试验中花药败育的切片结果与刘静等（2008）研究的萝卜花蕾败育的过程十分相似，不同之处在于萝卜不育系每个花药可以形成4个花粉囊，而本试验的不育系花药形成的花粉囊为2～4个各不相等。

前人的研究结果都表明花粉的败育与绒毡层的发育有着特殊的重要作用。周巍和许明（2007）认为，因为绒毡层最靠近花粉母细胞，花粉母细胞所需营养都是其供给的，绒毡层发生异常，就必然会引起花粉母细胞的发育异常。本试验中观察不育材料切片发现，在相当于花粉母细胞时期，细胞质雄性不育系09-R9的花粉囊内无绒毡层，可能是本身并未形成正常的绒毡层，这与聂明建等（2007）研究的甘蓝型油菜细胞质不育系392A在高温条件下未形成绒毡层的结果一致。

刘静，张鲁刚，王风敏.2008.萝卜花蕾败育过程中的组织细胞学特征观察.西北农业学报，17（5）：272-276.

聂明建，王国槐，朱卫平.2007.甘蓝型油菜3种类型雄性不育系花药败育的细胞学研究.中国农业科学，40（7）：1543-1549.

田如霞，武玲萱，崔贵梅.2010.春萝卜雄性不育系4205A小孢子败育的细胞学观察.华北农学报，25（6）：109-112.

谢潮添，杨延红，朱学艺，田惠桥.2004.白菜细胞核雄性不育花药的细胞化学观察.实验生物学报，37（4）：295-301.

杨光圣，矍波，傅廷栋.1999.三个甘蓝型油菜隐性核不育系小孢子发生的细胞学研究.华中农业大学学报，18（6）：520-523.

余凤群，傅廷栋.1990.甘蓝型油菜几个雄性不育系的细胞形态学研究.武汉植物学研究，（3）：119-216.

周巍，许明.2007.不结球白菜细胞核雄性败育过程的细胞学研究.安徽农业科学，35（6）：1600-1601.