黑龙江省部分地区鹅致病性大肠杆菌血清型鉴定及药敏试验

赵 阳，王艺萌，张文龙，马 波，王君伟

（东北农业大学 动物医学学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

我国是世界上养鹅数量和鹅食品消费量最多的国家。随着集约化养殖的普及，鹅致病性大肠杆菌对养鹅业的危害和导致的经济损失日益严重，成为目前危害养鹅业传染病之一。

鹅大肠杆菌病是由致病性大肠埃希氏杆菌所引起的一种传染病，不同品种和日龄的鹅均可发病，但仔鹅最易感。在临床上主要表现为败血症、纤维素性气囊炎、肝周炎、心包炎和腹膜炎。近年来，随着抗菌药物的大量应用，耐药菌株不断出现，鹅大肠杆菌病的发生有逐年上升的趋势，部分地区鹅大肠杆菌病的流行情况已比较严重。

本试验从黑龙江省部分地区中分离了鹅致病性大肠杆菌，并对鉴定出的大肠杆菌进行血清型分析和药敏试验，为了解鹅大肠杆菌病在本省的流行情况，指导用户选择合适的治疗药物以及制定科学的防治措施提供部分参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料 麦康凯培养基、普通营养琼脂培养基、马丁肉汤培养基，伊红美蓝琼脂培养基，均购自北京奥博星生物技术责任有限公司。微量发酵管，药敏纸片均购自杭州天和微生物试剂有限公司，大肠杆菌抗O1～O163因子血清，购自中国兽医药品监察所。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离培养及形态学观察 将病料无菌划线接种于麦康凯平板上，37℃培养24h。挑取麦康凯平板上的红色单菌落进行革兰染色，光学显微镜下观察。

1.2.2 生化试验 挑取革兰阴性短杆菌的单菌落在普通营养琼脂培养基上进行纯培养后，按说明书接种微量生化管。

1.2.3 血清型测定 取大肠杆菌试管斜面培养物划线接种麦康凯琼脂平板，37℃培养24h。挑取平板上光滑、圆整的单个红色菌落，接种普通琼脂斜面和液体肉汤培养基，37℃培养24h，培养期间肉汤振荡数次。用0.5%石炭酸生理盐水1.5mL洗下普通琼脂斜面培养物，置小试管中，与肉汤小瓶培养物一起于121℃高压2h。取小试管的高压抗原分别与大肠杆菌多价血清、单因子血清进行平板凝集反应。小试管用于平板凝集，肉汤小瓶抗原用于试管凝集。

血清型鉴定按中国兽医药品监察所提供的产品使用说明书进行操作。所有分离株首先经平板凝集试验初步筛选出可能的O血清型，然后通过试管凝集试验确定其O血清型。定型标准为血清的试管凝集价不小于1∶640。每次试验同时以高压抗原与0.5%苯酚生理盐水混合物作对照，观察有无自凝现象。3min内出现凝集者为阳性反应。

1.2.4 药敏试验 将分离到的61株大肠杆菌在无菌条件下分别接种肉汤培养基，然后放入摇床中培养6h后计数，调节菌液的含菌量为108个／mL。按常规纸片法进行药敏试验。

2 结果

2.1 细菌的分离培养 经37℃培养箱培养24h后，在麦康凯琼脂平板上形成红色的大小中等菌落。挑取单个红色单菌落划线接种于在普通琼脂平板上纯培养后，形成表面光滑、湿润、半透明、灰白色、圆形微凸起，中等大小的菌落。在伊红美蓝琼脂培养基上呈黑红色并有金属光泽。革兰染色镜检可见两端纯圆、多数散在排列，革兰阴性短杆菌。

2.2 生化试验 发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇，对蔗糖的发酵因菌株而异，产生靛基质，不分解尿素，不产生硫化氢，甲基红阳性，V-P阴性，柠檬酸盐阴性，均符合大肠杆菌的特性。

2.3 血清型的鉴定结果 61株鹅致病性大肠杆菌血清型鉴定结果见表1，各血清型的地区分布见表2。分离出的61株大肠杆菌，除3株因未出现玻板凝集反应或自凝而未能定型外，其余58株分属21个血清型。O9、O18、O64、O93共计32株，占全收集52.46%（32／61），11个地区分离到 O9、O18、O64、O93血清型，占全分离地区的69%（11／16），这4种血清型在黑龙江省内分布广泛，为优势血清型。其他分离出的血清型见表1。大肠杆菌的血清型分布比较分散，各地区分布无明显规律性。

表1 61株鹅致病性大肠杆菌分离株的血清型

2.4 药敏试验结果 药敏试验结果见表2，表明，分离菌株呈现出不同程度的耐药性，61株大肠杆菌对氧氟沙星和复达欣高敏比例分别为57%和51%，复方新诺明、先锋噻肟和氯霉素次之，分别为38%、34%和33%，氨苄青霉素、头孢呋肟、卡那霉素不足10%，四环素对所分离的菌株无抑制作用。氨苄青霉素、妥布霉素、阿米卡星、庆大霉素的耐药率高于66%，因此不建议应用于临床。大肠杆菌对10种药物的耐药率在50%以上，占所检药物的56%。耐药率低于33%的仅有3种，分别是先锋噻肟，复达欣，菌必治。

3 讨论

3.1 鹅致病性大肠杆菌血清型特点 对黑龙江省部分地区鹅致病性大肠杆菌的血清型鉴定结果表明，鹅场中致病性大肠杆菌的主要血清型是O9、O18、O64、O93共计32株，占全部收集52.46%（32／61），占全部调查区域的69%，是优势血清型。混合血清型 O8／O60，O13／O14，O18／O158，O101／O162在鹅首次分离到。近年来，多种大肠杆菌混合型的出现，在大肠杆菌病的防治上应引起重视。有关致病性大肠杆菌血清型鉴定国内外报道较多，各地区流行的优势血清型相差比较大。国外有研究报道，禽致病性大肠杆菌常见血清型为 O1、O2、O35、O78［1］，本次试验则分离出此4个主要血清型。国内血清型多且地区差异大［2-3］。虽然各地区血清型有部分交叉，但未发现规律性。本试验对61株大肠杆菌血清型的鉴定为黑龙江地区大肠杆菌病的防制提供了参考。优势血清型的出现，为研制有效的疫苗提供了科学的依据［4］。

3.2 黑龙江省鹅致病性大肠杆菌耐药谱的变化大肠杆菌易产生耐药性，可由染色体或质粒介导，它可以通过菌毛将耐药质粒传递给其他大肠杆菌［5］。临床常用的庆大霉素，氨苄青霉素，氟哌酸对分离的61株鹅致病性大肠杆菌抑菌作用较低，而妥布霉素，四环素，阿米卡星类对所分离的菌株几乎无抑制作用。细菌耐药性的发生和发展正是抗菌药物广泛应用，特别是无指征滥用的结果。极低的高敏率说明，多数药物对大肠杆菌的治疗效果一般，同时也易发生耐药性的恶化。

表2 61株鹅致病性大肠杆菌对18种抗生素的药敏

耐药率低于33%的仅有3种，分别是先锋噻肟，复达欣，菌必治，以上3种药物可以作为临床治疗的候选药物。所以在用药上，应遵循尽量窄谱的原则，能用窄谱的抗生素就不选用广谱抗生素，而且要先进行药敏试验，后用药，做到有的放矢，减少无故的耐药性产生。而且要注意，大肠杆菌用药一定要量足，因为大肠杆菌的繁殖非常快，大约18min就能繁殖一代，这样是避免体内药物浓度不足产生的耐药性变异。注意进行细菌耐药性的监测，在有限的条件下尽量避免耐药菌株的产生。多数菌株多重耐药严重，多重耐药菌株甚至出现了18耐的情况，13耐、14耐、16耐也不在少数。所以，交叉用药的方法也已经不可取了。所以，针对大肠杆菌耐药性的解决应是以后的重点。

［1］Blanco J E，Blanco M，Mora A，et al.Serotypes of Escherichia coli isolated from septicaemic chickens in Galicia（northwest Spain）［J］.Vet Microbiol，1998，61（3）：229-235.

［2］高崧，刘秀梵，张如宽，等.我国部分地区禽病原性大肠杆菌的分离与鉴定［J］.畜牧兽医学报，1999，30（2）：164-171.

［3］宋立，宁宜宝，张秀英，等.中国不同地区家禽大肠杆菌血清型分布和耐药性比较研究［J］.中国农业科学，2005，38（7）：1466-1473.

［4］窦大庆，彩尼瓦尔，古丽巴哈尔，等.喀什地区鸡大肠杆菌的分离鉴定及多价灭活苗的研制［J］.中国兽医杂志，2002，38（3）：19-20.

［5］Van Den Bogaard A E，London N，Driessen C，et al.Antibiotic resistance of faecal Escherichia coli in poultry，poultry farmers and poultry slaughterers［J］.J Antimicrob Chemother，2001，47（6）：763-771.