滑菇子实体多糖纯化工艺的初步研究

李德海，孙常雁，刘利

（1.东北林业大学 林学院，哈尔滨 150040；2.国家乳业工程技术研究中心）

滑菇（Pholiota nameko）别名为滑子蘑、珍珠菇、真珠菇、光帽黄伞、光帽鳞伞，属于真菌门、无隔担子菌纲、伞菌目、丝膜菌科、鳞伞属［1］，我国台湾地区称为“珍珠菇”。滑菇子实体味美营养，是一种低热量、低脂肪的保健食品。研究表明，滑菇子实体多糖含量丰富，而且具有多种生理活性，能够提高机体免疫力和耐力［2］，增进智力，改善视力，可预防葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎杆菌、结核杆菌的感染，此外对肿瘤具有较强的抑制作用，能够达到91%的抑制率［3－5］。因此本试验研究了滑菇多糖粗提物的初步纯化工艺，为滑菇多糖进一步研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

滑子蘑为市售干品；D101型大孔树脂；AB－8型大孔树脂；ADS－5型大孔树脂；葡萄糖；浓硫酸；苯酚；95%乙醇；无水乙醇；石油醚 ；乙醚；三氯甲烷；过氧化氢；盐酸；氯化钠；正丁醇。

1.2 实验仪器

高速万能粉碎机；振动筛；电热恒温鼓风干燥箱；电子天平；恒流泵；电脑自动部分收集器；水域恒温摇床；电热恒温水浴锅；可见光分光光度计；离心机；架盘药物天平；冰箱；分析天平；旋转蒸发器。

1.3 实验方法

1.3.1 多糖的测定：苯酚－硫酸比色法

1.3.1.1 葡萄糖标准曲线的制作：准确称取标准葡萄糖4mg于100mL容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4mL加蒸馏水至2.5mL，然后加入6%苯酚1.00mL及浓硫酸5.00mL，静置l0min，摇匀，室温放置30min后于490nm处测定溶液的吸光值。以多糖微克数为横坐标，溶液吸光值为纵坐标，制作标准曲线［6－7］。

y＝0.0073x＋0.0119（R2＝0.9977）

1.3.1.2 样品含量测定：将滑菇多糖提取液稀释一定倍数后，移取适量，用苯酚－硫酸比色法按上述步骤操作，测定溶液吸光值，以标准曲线计算多糖含量。

其中：X－ 滑菇多糖质量浓度（μg／mL）；

D－滑菇多糖样品液稀释倍数；

V－滑菇多糖样品液体积（mL）；

W－滑菇粗多糖干重（g）。

1.3.2 大孔树脂对滑菇多糖纯化工艺的研究

准确称取大孔树脂10.0g，经过预处理后置于100 mL三角瓶中。向三角瓶中加入滑菇多糖样品液，在恒温振荡器中振荡吸附一定时间，取样品液测定多糖含量，计算吸附率。

将上述吸附滑菇多糖的大孔树脂滤出，水洗，置于100mL三角瓶中，再加入洗脱剂。在恒温振荡器中振荡进行解析一定时间，取洗脱液测定多糖含量，计算解吸率。

将预处理后的大孔树脂上柱，平衡过夜，取粗多糖溶液上柱，吸脱剂洗脱，采用自动收集器收集洗脱液，采用苯酚－硫酸法检测多糖含量，确定最佳洗脱流速。

式中：A—吸附率（%）；

M1—吸附前样品液中多糖含量（mg）；

M2—吸附后样品液中多糖含量（mg）。

式中：D—解析率（%）；

M1—解析液中多糖含量（mg）；

M2—吸附前样品液中多糖含量（mg）；M3—吸附后样品液多糖含量（mg）；M4—水洗液中多糖含量（mg）。

2 结果与分析

2.1 滑菇子实体粗提物的多糖含量

在对滑菇多糖进行热水浸提的过程中，用苯酚－硫酸法对滑菇多糖的含量进行了跟踪检测。

对滑菇子实体粉末进行热水浸提，乙醇沉淀，烘干后，计算得率为7.21%，粗多糖中多糖含量为59.07%。

2.2 滑菇多糖纯化工艺的研究

2.2.1 树脂对滑菇多糖纯化效果的影响

不同树脂（ADS－5，AB－8，D101）对滑菇多糖纯化效果的试验结果如图1所示。

由图1的吸附曲线可知AB－8对滑菇多糖的吸附率最高可达85.42%，另两种树脂吸附能力相对较小。由解吸曲线可知AB－8，ADS－5对色素的解吸能力相当且分别为70.46%，71.28%，但是比较来讲我们选择相对较好的AB－8树脂，它对滑菇多糖有最好的解吸和吸附效果。

图1 不同树脂对滑菇多糖的吸附与解吸情况

2.2.2 洗脱剂对滑菇多糖纯化效果的影响

洗脱剂对滑菇多糖纯化效果的试验结果如图2所示。

图2 不同种类洗脱液对多糖的解吸情况

由图2可以看出：乙醇的解吸率明显高于NaCl溶液与蒸馏水，效果显著，所以选择乙醇作为多糖的洗脱剂。

2.2.3 pH对滑菇多糖纯化效果的影响

样品液pH对滑菇多糖纯化效果的试验结果如图3所示。

图3 不同pH值滑菇多糖溶液的吸附与解吸情况

由图3可知，当pH值从2变到时6，AB－8树脂对多糖的吸附能力有上升趋势，在pH为5时吸附率下降，在pH为5时有最大吸附率；解吸能力则先升高后降低，在pH为4的时候有小波动，但从总体趋势看在pH为5时的解吸率相对较高。因此纯化多糖时选择提取液的pH值为5，在此条件下树脂对滑菇多糖有最好的解吸与吸附效果。

2.2.4 解吸时间对滑菇多糖纯化效果的影响

解吸时间对滑菇多糖纯化效果的试验结果如图4所示。

由图4可知，当吸附时间从1h增加到3h时吸附率不断升高再到3h时则吸附率不再变化，当解吸时间由1h到4h时解吸率不断升高再到4h则吸附率不再发生变化，综上可知树脂最佳吸附时间为3h，最佳解吸时间为4h。

图4 不同时间对滑菇多糖溶液的吸附与解吸情况

2.2.5 样品浓度对滑菇多糖纯化效果的影响

样品浓度对滑菇多糖纯化效果的试验结果如图5所示。

图5 不同浓度的多糖溶液的吸附与解吸情况

由图5可知，随多糖浓度不断升高吸附率变化较小，但是在1.5mg／mL时有较大的吸附率，而解析率则先升高后降低，综合两种情况选择最优条件为1.5mg／mL时有最好的解吸率与吸附率。

2.2.6 洗脱液浓度对滑菇多糖纯化效果的影响

乙醇浓度对滑菇多糖纯化效果的试验结果如图6所示。

图6 不同浓度的洗脱液对多糖的解吸情况

由图6可以看出：乙醇的浓度由50%至70%时随着乙醇浓度的增加，洗脱的效果越来越好，当乙醇的浓度高于70%时解吸效果呈下降趋势，在90%时有轻微波动但是不影响整体趋势，所以确定最佳洗脱液浓度为乙醇浓度70%。

2.2.7 洗脱液流速对滑菇多糖纯化效果的影响

洗脱液流速对滑菇多糖纯化效果的试验结果如图6所示。

从图7可以看出，随流速的增加，树脂对多糖的解吸性能呈下降趋势，说明流速增加不利于树脂对多糖的解吸，若流速过快，洗脱剂不能与被吸附的多糖充分作用而将其从树脂上洗脱出来，但流速过低，将导致整个生产周期的延长，从上图分析后也可得出结论，每个流速对应的吸收峰应该是越窄越好。故本试验选择2mL／min作为洗脱流速，在此条件下试验的效果最好。

图7 洗脱液流速对滑菇多糖解吸情况的影响

4 结论

4.1 本文比较了3种大孔树脂对滑菇多糖的吸附和解吸效果，从中筛选出适合滑菇多糖分离纯化的树脂，并对其吸附和解吸条件进行了研究。对树脂筛选的试验结果为：AB－8大孔树脂对滑菇子实体多糖分离纯化的效果最好。

4.2 AB－8型树脂对滑菇多糖纯化工艺的结果为：吸附时间为3h、pH值5.0、料液浓度1.5mg／mL，洗脱剂为70%乙醇溶液，解吸时间为4h，洗脱速率为2mL／min，在此工艺下纯化效果最好，即吸附率为86.67%，解吸率为71.38%。

4.3 最后得到滑姑多糖纯品中多糖含量为78.64%，远高于粗多糖中的多糖含量59.07%，由此可知，大孔树脂是一种较为简单方便的纯化滑菇多糖的方法。

［1］白永莉，张玲勤.高海拔地区滑菇栽培技术初探［J］.食用菌，2000（6）：35－37.

［2］张彬，薛立群.多糖对动物免疫调控作用及其机理.家畜生态学报，2008（1）.

［3］张竞，潘琢，赵宝华.真菌多糖抗肿瘤作用的研究进展［J］.生命科学仪器，2009（4）：28－31.

［4］崔英俊，李庆章.滑菇多糖对衰老模型鼠不同时期免疫功能的影响［J］.东北农业大学学报，2004（2）：129－134.

［5］陈磐，陈绍瑗，冯懿挺，等.植物活性多糖抗癌活性的研究［J］.中国药物与临床，2004，4（8）：606－608.

［6］李德海，孙常雁，孙洁莉，等.微波辅助法提取滑菇多糖的工艺研究［J］.食品工业科技，2008（4）.

［7］王黎明，夏文水.蒽酮－硫酸法测定茶多糖含量研究［J］.食品学报，2005，26（7）.