沙棘脂肪酸对老龄雌性大鼠线粒体功能影响的研究

申屠平平,魏霞蓁,王振林,郭剑峰,宋兰兰

(1.西安交通大学天奎医药生物公司,陕西西安 710061;2.浙江省金华市疾病预防控制中心,浙江金华 321000;3.西安交通大学医学院营养与食品卫生教研室,陕西西安 710061)

沙棘脂肪酸组成分制备的更年期的中药制品,前期研究已证明具有调节内分泌、调节免疫功能、改善血液流变性和抗组织细胞衰老等作用,临床用以治疗妇女更年期综合征。本文为了探索衰老形成的作用机制,以沙棘脂肪酸配制成为能量调节剂,以线粒体为调控靶标,观察老年雌性大鼠线粒体内膜蛋白及辅酶成分,呼吸链功能、ATP生成等调节因素对衰老形成的影响,以揭示沙棘脂肪酸具有增加线粒体内膜蛋白及辅酶活性、调整改善呼吸链功能、促进机体多功能组织、细胞的新陈代谢等作用[1]。

1 仪器与材料

1.1 仪器

高通量酶标仪 (德国BMG公司);超高速冷冻离心机 (美国BECKMAN公司);生物氧特性微机测量分析仪 (北京空军第六装备研究所);DY89—Ⅱ型电动匀浆机 (宁波新芝);759紫外分光光度计 (浙江福立分析仪器有限公司)。

1.2 药物

沙棘脂肪酸组成分 (由西安交大天奎医药生物公司提供,批号 20040605。取内容物为4.50g/kg、2.25g/kg、1.125g/kg乳剂);已烯雌酚 (天津力生制药股份有限公司,产品批号0401200,溶于同种赋形剂制成0.02mg/kg乳剂);赋形剂为0.72g/kg的伯洛沙姆。

1.3 试剂

EDTA-2Na、ATP-2Na(Amresco公司);氯化镁 (上海生工生物工程有限公司);维生素C、琥珀酸钠、苹果酸、琥珀酸、硼氢化钠、细胞色素 C、鱼藤酮、抗霉素A、CoQ10、蔗糖(Sigma公司);2,6-二氯酚靛酚 (2,6-DCPIP)(Fluka公司);琥珀酸脱氢酶、ATP酶测试盒、总蛋白测试盒、总蛋白标准品、磷测试盒 (南京建成生物工程研究所);其余生化试剂均为分析纯。

1.4 动物及分组

健康20月龄Wistar雌性大鼠63只,质量(300±12)g,由北京中科院药物研究所实验动物中心提供。随机均分为5组:沙棘脂肪酸组成分 (以下简称天癸)高、中、低剂量组、雌激素组、老年对照组;另将13只6月龄雌性大鼠为青年空白对照组。

2 方法

2.1 给药方法

大鼠按0.01ml/kg体重每天定时灌胃给药,各组剂量如下:天癸高、中、低剂量组依次为4.50g/kg、2.25g/kg、1.125g/kg;雌激素组给予已烯雌酚0.02mg/kg。青年及老年对照组给予赋形剂。连续给药90d停药,空腹12h后,麻醉,取样。

2.2 标本制备

动脉插管取血约2ml,室温静置2h,离心取上清,分装后-20℃冰箱保存。迅速开腹,取肝脏,冰浴条件下制备肝匀浆,0℃高速提取线粒体,部分用于测定线粒体呼吸功能,其余分装后-20℃保存。

2.3 检测

线粒体呼吸控制率 (RCR)、磷氧比 (P/O)及氧化磷酸化效率 (OPR)采用Clarck氧电极法测定线粒体呼吸功能各项指标[2]。

线粒体复合酶活性:按Veitch等的方法分别测定复合酶Ⅰ～Ⅳ活性[3]。

线粒体ATP合成酶活性:用无机磷检测试剂盒测定Pi含量以代表ATP酶活性。线粒体ATP合成酶是一种可逆性酶,当ATP量远多于ADP时,ATP合成酶分解ATP成ADP和无机磷,测定无机磷的量,可计算ATP合成酶的活性。

线粒体Ca2+-ATP酶活性:按照ATP酶测试盒说明操作。

线粒体琥珀酸脱氢酶活性:按照琥珀酸脱氢酶试剂盒说明操作。

2.4 统计学方法

应用统计软件 SPSS11.5进行单因素方差分析。

3 结果

3.1 实验大鼠一般状况

各组大鼠基本状况良好,用药2周以后背毛变得有光泽,绒毛感增强,行动自如,未见其他异常表现;老年对照组大鼠行动较为迟缓,毛色粗糙成束,脱毛现象比较普遍,老年特征明显。

3.2 大鼠线粒体复合酶活性

与老年组相比,青年组及天癸高、中剂量组复合酶Ⅰ明显升高,差异有统计学意义 (P＜0.05);青年组复合酶Ⅱ活性高于老年组 (P＜0.05);沙棘脂肪酸实验组及雌激素组比老年对照组酶活性升高;青年组、沙棘脂肪酸高、中剂量组及雌激素组复合酶Ⅲ活性显著高于老年组(P＜0.01或P＜0.05,);与老年组相比,青年组和雌激素组复合酶Ⅳ活性显著升高 (P＜0.01或P＜0.05);沙棘脂肪酸组成分高中低剂量实验组复合酶Ⅳ活性高于老年组呈升高趋势,详见表1。

表1 大鼠线粒体复合酶Ⅰ-Ⅳ活性测定结果(nmol.mg-1.min-1,x±s)

3.3 大鼠线粒体呼吸功能

与老年组比较,青年组、沙棘脂肪酸实验组及雌激素组OPR升高,差异有统计学意义 (P＜0.01或P＜0.05);青年组、沙棘脂肪酸中剂量组和雌激素组ADP/O比值高于老年组 (P＜0.01或P＜0.05);与老年组比较,青年组和雌激素组RCR(P＜0.05)、沙棘脂肪酸高中低实验组RCR值升高 (P＞0.05)但呈升高趋势,详见表2。

表2 各组大鼠线粒体呼吸功能测定结果(nmol.mgprot-1.min-1,±s)

表2 各组大鼠线粒体呼吸功能测定结果(nmol.mgprot-1.min-1,±s)

注 与老年对照组比较 *P＜0.05,**P＜0.01。

组 别 剂 量(g/kg) n RCR ADP/O OPR脂肪酸高剂量 4.50 9 1.57±0.27 1.87±0.49 41.07±10.20*脂肪酸中剂量 2.25 9 1.59±0.34 1.96±0.65* 42.30±12.27*脂肪酸低剂量 1.125 10 1.47±0.32 1.87±0.45 39.32±10.85*雌激素 0.02×10-3 13 1.67±0.64* 1.96±0.58* 41.47±10.00*老年对照 等体积 9 1.26±0.19 1.45±0.22 25.07±4.54青年对照 等体积 11 1.73±0.39* 2.02±0.82** 46.18±13.39**

3.4 大鼠线粒体ATP合成酶活性

与老年组比较,沙棘脂肪酸实验组高、中、低剂量组和青年组 ATP合成酶活性显著升高(P＜0.05或P＜0.01)。雌激素组ATP合成酶活性 (P＞0.05)见表3。

表3 各组大鼠线粒体ATP合成酶活性测定结果 (μ mol.mg-1.hour-1,±s)

表3 各组大鼠线粒体ATP合成酶活性测定结果 (μ mol.mg-1.hour-1,±s)

注 与老年对照组比较 *P＜0.05,**P＜0.01。

组 别 剂 量(g/kg) n ATP合成酶活性脂肪酸高剂量 4.50 12 0.31±0.04*脂肪酸中剂量 2.25 12 0.31±0.05**脂肪酸低剂量 1.125 13 0.29±0.08*雌激素 0.02×10-3 14 0.28±0.06老年对照 等体积 12 0.24±0.04青年对照 等体积 13 0.34±0.07**

3.5 大鼠线粒体Ca2+-ATP酶活性

与老年组比较,天癸高、中剂量组及青年组Ca2+-AT P酶活性明显升高,差异显著 (P＜0.01),其中沙棘脂肪酸高、中剂量组与青年组接近。雌激素组Ca2+-ATP酶活性 (P＞0.05)见表4。

3.6 大鼠琥珀酸脱氢酶活性

与老年组比较,青年组酶活性显著升高 (P＜0.05),沙棘脂肪酸实验组SDH酶活性呈升高趋势,尤其是高剂量组升高值远高于老年组和雌性激素组,见表5。

表4 各组大鼠线粒体Ca2+-ATP酶活性测定结果(μmol.mg-1.hour-1, ±s)

表4 各组大鼠线粒体Ca2+-ATP酶活性测定结果(μmol.mg-1.hour-1, ±s)

注 与老年对照组比较*P＜0.05,**P＜0.01。

组 别剂 量(g/kg)nCa2+-ATP酶活性脂肪酸高剂量4.50120.29±0.04**脂肪酸中剂量2.25120.29±0.04**脂肪酸低剂量1.125120.25±0.04雌激素0.02×10-3130.24±0.03老年对照等体积120.22±0.04青年对照等体积120.30±0.05**

表5 各组大鼠琥珀酸脱氢酶活性测定结果(U.mg-1.hour-1, ±s)

表5 各组大鼠琥珀酸脱氢酶活性测定结果(U.mg-1.hour-1, ±s)

注 与老年对照组比较 *P＜0.05,**P＜0.01。

组 别 剂 量(g/kg) n 琥珀酸脱氢酶活性脂肪酸高剂量 4.50 12 4.21±0.67脂肪酸中剂量 2.25 12 4.09±1.15脂肪酸低剂量 1.125 13 3.54±0.96雌激素 0.02×10-3 14 3.77±1.15老年对照 等体积 12 3.50±1.02青年对照 等体积 13 4.52±1.17*

4 讨论

研究结果揭示,沙棘脂肪酸组成分可能对线粒体呼吸链复合体Ⅰ～Ⅳ的质子泵起作用,并促进线粒体呼吸链传递电子过程。本动物试验证实,沙棘脂肪酸组成分不仅改善了线粒体内膜复合酶Ⅰ～Ⅳ活性功能,使AT P合成酶生成显著性增加,更重要的是药物调节线粒体内膜蛋白质和辅酶成分,增强了机体的生物能量的转换作用。本次试验与前期的研究进行关联分析显示:沙棘脂肪酸组成分增强了复合酶Ⅰ～Ⅳ、ATP合成酶活性功能,激活了机体环核甘酸CAMP/CGMP第二信使,并产生生物功能的集合放大作用;调整了老龄雌性大鼠因衰老所致血清中的CAMP/CGMP浓度比值紊乱;并激活机体CAMP/PKA、Ca2+-ATP酶活性的信号调节通路[4]。

随着年龄的增加,人的肝脏和骨骼肌中及其他组织中表现为线粒体的呼吸链的氧化代谢功能下降,氧化磷酸化效率降低,线粒体的结构受到破坏,呼吸链组成酶类和AT P的合成效率下降现象[5]。本实验结果与文献报道一致。

Ca2+作为普遍存在的细胞内第二信使,在细胞生命活动中起到重要作用。随着年龄的增加,细胞内Ca2+呈渐进性增加。细胞内钙超载对线粒体及能量代谢产生消极影响。细胞内游离钙病理性增加之后,则需要细胞内的Ca2+调控机制发挥作用,以维持细胞内钙稳态。Ca2+-ATP酶在Ca2+的稳态中发挥重要作用。但研究发现,随着老龄化的发生,细胞内的Ca2+调控能力是逐渐衰退的,细胞膜钙泵活性随着年龄增加而显著降低,外排Ca2+的能力明显下降[6]。本实验结果显示,天癸实验组Ca2+-ATP酶活性都显著高于老年组,线粒体细胞膜钙离子转运能力提高,可以缓解细胞内钙离子超载状态。这与前期实验结果药物实验组线粒体内游离钙离子浓度明显低于老年组相一致。

琥珀酸脱氢酶既是三羧酸循环的限速酶之一,又是线粒体内膜的标志酶。它的作用对肝细胞的观察发现,由核编码的琥珀酸脱氢酶活性在衰老时没有明显的变化[7]。本实验结果表明,老年组SDH活性与青年组比较无显著性下降,沙棘脂肪酸组成分服药组,其衰老大鼠下降的SDH活性含量达到改善并有升高趋势。其SDH在体内三羧酸循环中是通过辅酶与脱氢酶结合形成变位酶的作用而改变琥珀酸的活性,还是SDH在体内代表独立的催化实体起作用有待于在以后的实验研究中加以证实。

综上所述,沙棘脂肪酸组成分以线粒体作为抗衰老调控靶标,是因为线粒体参与人体三羧酸循环、氨基酸代谢、脂肪酸分解、电子传递、能量转换、DNA复制和 RNA合成等生命运动的过程。沙棘脂肪酸组成分具有增强线粒体内膜蛋白辅酶活性,保护线粒体功能的抗氧化损伤,促进线粒体呼吸功能和氧化磷酸化功能,使线粒体的细胞新陈代谢功能 (放能、储能、转化能)得以在体内进行自主平衡性的调节,而使DNA复制和 RNA合成得以正常进行达到调节抗衰老目的。

[1] 周志东,赵伟康,金国琴.老年大鼠线粒体能量代谢及其调控的研究 [J].中国老年学杂志,2001,21(3):208-210.

[2] 邱宏,金国琴,张学礼.调心方对氧化损伤型类AD大鼠能量代谢的影响[J].中药药理与临床,2002,18(1):18-21.

[3] 熊杰,冯亦璞.丁基苯酞对线粒体呼吸链复合酶活性的影响 [J].药学学报,1999,34(4):241-245.

[4] Hu R,Yuan BX,Wei XZ.Enhanced CAMP/PKA pathway by seabucthorn fatty acid in Aged rats[J].Pharmacol Exp Ther,2007,10(1):248-254.

[5] 陈永红,杜冠华.线粒体与衰老[J].中国药理学通报,2000,16(5):485-488.

[6] 马铁明.脾气虚证、脾阳虚证和脾阴虚证老年大鼠模型心、脑组织中mtDNA缺失、呼吸链复合体酶活性的变化以及补益脾胃方药作用机制的实验研究[J].辽宁中医学院,2004,10(1):23-27.

[7] 郑国锠.细胞生物学 [M],4版.北京:高等教育出版社,2003:189-191.