低温产甲烷复合菌系的选育及产甲烷活性影响

东北农业大学资源与环境学院 ■ 赵忠宝 徐凤花 郭建全 李娜 黄刚

一 引言

目前国内沼气发酵以中、高温为主，低温研究尚处探索阶段。有研究者认为低于20℃沼气发酵速度急剧下降。在我国北方由于低温的限制，同样数量的沼气原料产气量往往不及夏季的1/3，严重限制了沼气在我国北方推广。低温季节进行沼气发酵，如果人为加热就会增加运行成本，因此，选育低温高效的产甲烷复合菌系对低温沼气发酵具有重要的现实意义。

本试验采用不同生境来源的样品，利用温度对微生物的选择作用进行低温驯化，以期选育出稳定的低温高效产甲烷复合菌系，为低温沼气发酵提供微生物资源及重要试验参数。

二 材料与方法

1 材料

(1) 样品来源

样品取自稻田灌溉渠污泥D、沼气发酵液Z、厌氧污泥Y、牛瘤胃液W等厌氧环境，用充满氮气的取样瓶采集样品1.5L，密封，尽量避免样品与空气接触。

(2) 培养基(g/L)

K2HPO40.3，KH2PO40.3，(NH4)2SO40.3，NaCl 0.6，MgSO4·7H2O 0.13，CaCl2·2H2O 0.008，NaHCO35，FeSO4·7H2O 0.002，Na2S·9H2O 0.5，L-半胱氨酸0.5，甲酸钠2.5，乙酸钠2.5，酵母膏2.0，胰蛋白胨2.0，0.1%刃天青2mL，青霉素(96万单位/g)2.0，微量元素10.0mL，维生素溶液10.0mL。

微量元素液(g/L)：MgSO4·7H2O 3.0，CoCl20.1，MnSO4·2H2O 0.5，CaCl2·2H2O 0.1，NaCl 1.0，ZnSO4·7H2O 0.1，FeSO4·7H2O 0.1，CuSO4·5H2O 0.01，AlK(SO4)20.01，H3BO30.01，NaMoO4·2H2O 0.01。

维生素溶液(mg/L)：硫胺素(维生素B1)5.0，泛酸钙5.0，核黄素(维生素B2)5.0，盐酸吡多醇10.0，生物素2.0，叶酸2.0，钴胺素(维生素B12)0.1，烟酸(维生素B5)5.0，氨基苯甲酸5.0，硫辛酸5.0。

牛粪酸化液：取10kg牛粪与10L温水混合均匀，自然酸化待pH值降至6时，用KHCO3溶液将其pH值调至7，用时将TS[1]调至8%。

2 方法

(1) 低温产甲烷复合菌系的驯化

500mL葡萄糖瓶中装300mL产甲烷菌富集培养液，然后驱氧、灭菌备用，再接入25%样品，三次重复。密封后放入19±0.5℃恒温培养箱培养中，定期测定产气量及CH4含量，将产气量、CH4含量高的培养物继代培养，直至获得性能稳定的复合菌系。

(2) 产气量及气体成分测定

以排水法测定产气量，装置如图1。气体成分分析采用气相色谱GC-14C，TDX-01不锈钢填充柱，80～100目，2m×3mm，TCD检测器，载气为氮气(99.99%)，流速为35mL/min，进样口温度、柱温、检测器温度分别为150、130、150℃，桥电流80mA。

以外标法确定CH4含量标准曲线，气体检测环境温度为25℃。确定峰高与CH4含量的关系为y=0.002x−18.56，R2=0.998。

(3) 不同温度对产甲烷活性影响研究

按照Hungate厌氧操作改良技术，取60mL富集培养物加入到240mL培养液中，在5、10、15、20、25、30、35℃不同温度条件下进行培养，每个温度处理设置3次重复，定期测定产气量及甲烷含量。

(4) 碳源基质研究

按照Hungate厌氧操作改良技术，取60mL富集培养物加入到240mL培养液中进行培养，培养液分别以甲醇、甲酸钠、乙酸钠为唯一碳源，设置3次重复，定期测定产气量及甲烷含量。

(5) 统计分析方法

试验数据采用SPSS V17.0数据分析软件进行统计分析，并用Tukey固定极差法进行多重比较差异显著性。

(6) 形态观察

Nikon YS100光学显微镜；荧光显微镜(DM4000B，德国Leica公司)；S-3400N扫描电子显微镜。

三 结果与分析

1 不同生境来源的复合菌系总产气量变化动态

不同生境来源样品在低温驯化过程中随着传代次数的增加总产气量也随之增加，第6～8代总产气量基本稳定。不同复合菌系总产气量变化动态如图2所示。结合各代间总产气量显著性检验分析(表1)可知，复合菌系Y、D、Z总产气量从第一代至稳定代持续增加，并分别在第七、八、六代基本稳定；复合菌系W总产气量在第二代至第四代和第五代至第七代总产气量增加幅度较大，第七代总产气量开始稳定；四个复合菌系稳定时，总产气量高低依次为D、Z、Y、W。

表1 不同复合菌系驯化过程总产气量显著性检验

四种低温产甲烷复合菌系产气量方差分析[2]：假设H0：µD=µZ=µY=µW，则HA：µD-µZ-µY-µW。根据F值表，当df1=3，df2=3时，F0.05=9.28，F0.01=29.46，F=71＞F0.01=29.46＞F0.05=9.28，否认H0推断，四个低温产甲烷复合菌系产气量平均数差异显著(表2)。

表2 不同低温产甲烷复合菌系产气量方差分析

Tukey固定极差法检验结果表明，不同环境来源的低温产甲烷复合菌系产气量差异达到极显著(表3)。可见样品来源不同，驯化稳定后其产气量差异显著，因此产甲烷菌系驯化可有针对性地进行样品采集。

表3 不同低温产甲烷复合菌系产气量平均数间差异Tukey固定极差法检验

2 不同低温产甲烷复合菌系产气动态

四种低温产甲烷复合菌系产气动态如图3～图6所示。接种培养一天后均有少量气泡出现并缓慢向上涌动，复合菌系Y、W、D、Z分别在第3d、6d、6d、6d开始测定产气。复合菌系Y从第6d至第26d出现多次产气高峰而且产气高峰较密集，产气高峰仅间隔1～2d，高峰时日产气量为115～150mL；第26d后产气量基本稳定，日产气量在60～90mL持续10d；稳定期后产气量连续出现4次高峰，此阶段产气高峰间隔也在2d内，而且最高日产气量为190mL，较上一高峰期最高日产气量提高27%；随后产气再次稳定，最后产气缓慢下降，64d产气过程中CH4纯度在50%以上达到57d。

复合菌系W产气高峰期出现在第11d至第26d，此期间三次产气高峰的高峰间隔均为4d，高峰时日产气量为125～150mL；然后产气基本稳定，日产气量在50～90mL持续32d；然后再次出现高峰，之后产气下降，产气67d中CH4纯度在50%以上达到60d。

复合菌系D进入产气高峰期后出现8次产气高峰，并没有明显的产气稳定期，高峰时日产气量在110～205mL持续39d，然后产气缓慢下降，65d产气过程中CH4纯度在50%以上达到54d。

11～24d间复合菌系Z出现三次产气高峰，两次高峰间隔为6d和3d，高峰时日产气量在150～180mL；第27d产气量开始缓慢下降，日产气量降到45mL时即第35d产气又开始上升，当升至80mL后趋于平稳；第65d日产气量再一次下降，第71d产气结束，CH4纯度在50%以上共有62d。

四种不同来源的样品经过19.5±0.5℃低温驯化稳定后，其总产气量、甲烷含量及原料产气率各不相同且差异较大，如表4所示。300mL体系料液浓度为8%时，复合菌系Y、W、D、Z的总产气量分别达到5317.0mL、5046.0mL、5913.0mL、5645.0mL，甲烷含量依次为65.0%、61.0%、69.9%、67.5%，TS产气率分别为222.00L/kg、214.00L/kg、246.00L/kg、235.00L/kg。目前研究相同物料浓度下的中温发酵TS产气率218～262L/kg[3,4]，可见复合菌系Y、W、D、Z均达到中温产气水平。

表4 产甲烷复合菌系的产气特性

3 不同温度对复合菌系D甲烷产量的影响

根据最适生长温度(Topt)不同，研究者将产甲烷菌分为嗜冷(Topt低于25℃)、嗜温(Topt约为35℃)、嗜热(Topt约为55℃)和极端嗜热(Topt高于80℃)4个类群[5]，其中嗜冷产甲烷菌又分为专性嗜冷产甲烷菌(Topt低于15℃)和兼性嗜冷产甲烷菌(Topt高于15℃)。由图7可知，复合菌系D在5～20℃范围内，甲烷产量随着温度的升高逐渐提高；在20～35℃范围内随温度升高而下降；在20℃时，该复合菌系甲烷产量最高。为了验证甲烷产量与温度之间的关系，建立了二者之间的二次回归方程见表5。回归方程验证表明，复合菌系D在22.0℃培养条件下甲烷产量最高，因此22.0℃为其产甲烷最适宜温度。在厌氧消化分类中小于25℃属于嗜冷消化[6]，可见该复合菌系D能够进行低温厌氧发酵并且产气指标达到中温产气水平，进一步证明了嗜冷消化是可行的[7～9]。

表5 甲烷产量与温度T的二次回归方程(Y=aT2+bT+c)

4 不同碳源对复合菌系D甲烷产量的影响

产甲烷菌能够利用甲醇、甲酸、乙酸等一碳或二碳化合物合成细胞物质及甲烷，研究复合菌系中产甲烷菌营养类型可以为其提供最适碳源，提高甲烷产量。由表6可知，分别以甲醇和甲酸钠为唯一碳源时，甲烷产量变化不明显；乙酸钠为唯一碳源时，甲烷产量低于甲醇和甲酸钠。由此说明，该复合菌系中大部分产甲烷菌营养类型为甲基营养型，还有乙酸盐营养型。Kleikemper2005年研究证明，甲烷八叠球菌科中的甲烷鬃毛菌属只能利用乙酸盐发酵产生能量，甲烷八叠球菌科中的绝大多数属更易利用甲醇以及相关的甲基化合物产生甲烷。

表6 底物的利用

5 低温复合菌系D的形态研究

产甲烷古菌细胞内有两种特有的F420和F342辅酶，能在一定波长范围内产生蓝绿色荧光，因此荧光数量一定程度上可以反映产甲烷古菌的数量[10]。由图8可以看出，复合菌系D经过低温驯化荧光数量有了大幅度的增加，亮度也强于驯化前，说明在低温驯化过程中，产甲烷菌得到富集。

通过光学显微照片和电镜照片(图9、图10)可以看到，驯化后复合菌系D中杆菌数量减少，球菌数量增多，并以八叠球菌为主。现报道的低温产甲烷菌中八叠球菌有Methanosarcina、Methanococcoides、Methanolobus和Methanosaeta等甲烷八叠球菌目，样品采集自南极[11]、高纬度湖水[12]、沼泽[13]、低温厌氧反应器等。复合菌系D样品采集自稻田灌溉渠污泥，这与已报道的水稻土中占优势的产甲烷菌种群为甲酸甲烷杆菌(Methanbacterium formicicum)、马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)和巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)[14]相一致。

四 结论

(1) 通过低温驯化从不同生境样品中选育出了复合菌系D、Z、Y、W，不同低温产甲烷复合菌系间总产气量差异达到极显著水平，甲烷含量均达到60%以上，TS产气率达到中温产气水平。

(2) 由温度与甲烷产量间二次回归方程验证可知，复合菌系D在22℃培养条件下甲烷产量最高；碳源基质研究表明菌系中大部分产甲烷菌营养类型为甲基营养型，还有乙酸盐营养型；通过菌群形态研究，该复合菌系中以球菌为主，八叠球菌居多。

[1]鲍士旦,江荣风.土壤农化分析(第三版)[M].北京: 中国农业出版社,2007:22－24.

[2]毛达如.植物营养研究方法[M].北京: 中国农业大学出版社,2002:192－201.

[3]王丽丽,杨广林,李文哲,等.20～30℃牛粪厌氧发酵产气特性的试验[J].东北农业大学学报,2006,37(6):791－795.

[4]张翠丽,李轶冰,卜东升,等.牲畜粪便与麦秆混合厌氧发酵的产气量、发酵时间及最优温度[J].应用生态学报,2008,19(8):1817－1822.

[5]李美群,邓洁红,熊兴耀,等.产甲烷菌的研究进展[J].酿酒科技,2009,179(5):90－93.

[6]Connaughton S,Collins G,O'Flaherty V.Psychrophilic and mesophilic anaerobic digestion of brewery effluent:A comparative study[J].Water Research,2006,40(13):2503－2510.

[7]Kettunen R H,Rintala J A.Performance of an on-site UASB reactor treating leachate at low temperature[J].Water Research,1998,32(3):537－546.

[8]Mahmouda N,Zeemana G,Gijzenb H,et al.Anaeobic sewage treatment in a one-stage UASB reactor and a combined UASBDigester sytem[J].Water Research,2004,38(9):2348－2358.

[9]Luostarinen S,Sanders W,Katarzyna K B.Effect of temperature on anaerobic treatment of black water in UASB-septictank systems[J].Bioresource Technology,2007,98(5):980－986.

[10]庞德公, 杨红建.产甲烷菌的分离纯化培养及其培养基对于菌株的选择作用[J].中国畜牧兽医, 2010,37(6):32－35.

[11]丁维新,蔡祖聪.温度对甲烷产生和氧化的影响[J].应用生态学报,2003,14(4): 604－608.

[12]Earl J,Pickup R W,Ritchie D A,et al.Development of temporal temperature gradient electrophoresis for characterisingmethanogen diversity[J].Microbial Ecology,2005,50(3):327－336.

[13]Munson M A,Nedwell D B,Embley T M.Phylogenetic diversity of archaea in sediment samp les from a coastal saltmarsh[J].Applied and Environmental Microbiology,1997,63(12):4729－4733.

[14]陈美慈,阂航,钱泽澎.水稻田中产甲烷菌数量和优势种[J].土壤学报,1993,30(4): 432.