建立稳定性指示性的分析方法在药物分析领域的研究进展

郝 福 胡向青

（以岭医药集团研究院，北京 101500）

稳定性指示性的分析方法（Stability-indicating method）是指一种应用于制药工业中稳定性样品的测试方法，利用这类方法测定样品能够反映出在稳定性试验条件下产品质量的变化。FDA、ICH、EMEA等各类药政部门都对该方法有严格的要求。这种方法因为具有良好的专属性，因此被广泛地应用于药物的质量控制、药物的稳定性研究、及体内药物分析等领域，本文综述了这一方法在药物分析领域的研究进展。

1 稳定性指示性分析方法的各种法规要求

美国联邦法典[1]21CFR 211.166（a）3要求“稳定性测试方法应该是一个可信赖的专属性方法”。FDA“稳定性试验研究指南（1998）”里指出[2]，对于已经验证过的定量分析方法应该具有良好的专属性。ICH的Q1A（R2）里提到[3]，稳定性测试的分析方法应该经过全面地验证并且具有稳定性指示性的特点。ICH的Q2A和Q3B里要求[4,5]，对于药物的含量测定和杂质（或降解产物）测定，需要建立并验证一个稳定性指示性的分析方法。

建立科学的稳定性指示性方法，对于制药研发部门来说，它不仅可以间接地为患者提供了安全有效、稳定的产品，而且可以降低商业运作过程中的风险，树立制药企业的声誉。

2 建立稳定性指示性分析方法的技术要求

随着科技的进步和科研实力的提高，多种先进的分析手段被应用到药物分析领域，如HPLC、UPLC、GC、CE等，这些方法都是基于各种分离机理设计的，广泛地收载于各国药典；另外一些方法，如紫外/可见分光光度法、比色法、衍生化法、滴定法等，这些方法专属性较差，因此实际应用经常受到限制。

各种法规对于“稳定性指示性方法”的解释都强调了一个词汇“专属性”，通常采用以下几种手段达到判断方法专属性的目的：①降解研究，即样品经过放置在强力破坏的试验条件下测定，如光、热、湿、酸碱水解及氧化条件，降解试验能在很大程度上对分析方法的专属性进行验证。②考察临界分离度，即用两个洗脱程度最接近的化合物的分离度来证明其专属性。③在空白基质或辅料中定量地加入主成分或杂质，与未添加的样品测试结果进行比较，以证明其测定结果不受这些物质的影响。

检索国内外相关的指导原则，未见对强制降解试验的具体试验条件作明确的规定。本文在检索相关资料[6-9]的基础上，归纳了强制降解试验的常规项目与部分试验条件，见表1。

每种试验条件均需要平行制备空白溶剂对照、空白辅料对照或其他质控样品，以判断所产生的降解物质或未知峰的来源。在设计各项目的具体试验条件时，应结合药物的剂型、工艺条件等进行综合考虑，掌握合适的强制降解试验程度，一般控制主成分降解5%～10%为最佳破坏条件；对于用色谱理论建立的测试方法，还需要计算破坏后整个物质的回收率，即物料平衡，回收率应达到95%～105%，避免因为检测系统选择不佳导致部分杂质/降解产物漏检的问题。对于破坏性试验中产生的较大降解产物，必要时进行定性分析。

表1 典型的原料药/制剂降解研究的试验条件

建立稳定性指示性方法，主要有以下几个步骤[6-9,14]：①首先剖析待分析物的化学结构，评估可能的降解途径；从化学结构可以获得很多信息，功能基的种类可以预测化合物的稳定性及溶解性等，如酰胺、酯、内酰胺、内酯都容易水解，硫醇、硫醚容易被氧化等。②收集化合物的物理、化学信息，如溶解性、pKa、logP、最大吸收波长、晶形、热稳定性、原辅料相容性等；③开展降解研究，利用降解研究的样品开展初步的分离试验；对于液相色谱，利用PDA检测器或质谱检测器可以评价峰纯度。④方法的最终建立和优化；⑤对降解产物进行结构鉴定，制备杂质对照品；质谱技术在药物降解产物或代谢物的定性、定量研究中日益发挥着越来越重要的作用。

3 对分析方法进行验证

对于不同类型的分析方法有不同的验证要求，美国药典将分析方法分为4类，对每一种类型的方法都提供了要求[10]，见表2。

4 稳定性指示性分析方法在药物分析中的应用

4.1 稳定性指示性HPTLC法的应用进展

HPTLC法（高效薄层色谱法）是将传统的薄层色谱法仪器化，采用高效薄层板和高质量的薄层扫描仪，大大提高了薄层板的分离能力和定量结果的准确性与重复性。

Faiyazuddin等[11]建立了具有稳定性指示性的HPTLC法测定硫酸特布他林原料药及制剂产品中的含量，作者考察了硫酸特布他林在酸、碱、氧化、光照条件下各斑点的分离情况，结果各降解产物与主成分分离度均良好。Mostafa等[12]建立了稳定性指示性的薄层色谱扫描法测定扑热息痛原料药和制剂的含量，结果，扑热息痛的Rf值为0.32，其它两个降解产物的Rf分别为0.45和0.76。EI-Saharty等[13]建立并验证了测定盐酸匹哌氮酯原料药含量的薄层扫描法，结果该方法可以特异性地检测在有碱降解产物存在的条件下盐酸匹哌氮酯的含量，盐酸匹哌氮酯和其碱降解产物的Rf值分别为0.28和0.51。

表2 分析方法验证指标的要求

HPTLC法可以使用少量的溶剂同时运行多个样品，分析效率较高，但是因为该方法缺乏优良的检测限、变异性、重复性，今后的应用还需加强研究，然而，该方法非常适宜于药物的初始降解研究，它配合HPLC可以跟踪降解产物的个数，并适量分离制备一些杂质[14]。

4.2 稳定性指示性HPLC/UPLC法的应用进展

HPLC法具有分析准确度好、选择好、重复性好、灵敏度高等优点，不论药物极性的大小，热稳定性好坏等都可以使用HPLC法检测，因此该法广泛地应用于药物杂质及降解物的分析检测。

Kasawar等[15]建立了稳定性指示性的HPLC法同时测定复方硫酸沙丁胺醇和异丙托溴铵鼻喷剂中的有关物质，该方法采用梯度洗脱，使用峰纯度指数评价降解研究中杂质的分离情况，并系统考察了方法的耐用性情况。Srinivasu等[16]建立并验证了稳定性指示性的梯度HPLC法，该方法可以特异性地检测乙酰唑胺及其有关物质。作者研究了各种强制条件下杂质分离和检出情况，对含量较大的降解产物采用LCMS、FTIR and 1H/13C NMR进行了结构鉴定，结果，该方法对乙酰唑胺与其4个已知杂质及降解产物间的分离度都不低于2.0。Rao等[17]建立并验证了用于测定原料药及制剂中硫酸氢氯吡格雷片及其有关物质的正相HPLC法，该方法能够分离所有已知杂质包括异构体杂质。

UPLC因为具有分析速度快，分离效率高的优点已逐渐进入药品质量控制领域。Lakshmi Narasimham等[18]建立并验证了一个可以同时检测β受体阻断剂和利尿药的UPLC法，所有化合物在3.3min内都达到了很好的分离，碱降解研究结果表明，2种新降解产物都用UPLC/MS进行了结构鉴定，该方法按照ICH指南进行了系统的方法验证。

综上所述，在药品的杂质控制上，稳定性指示性HPLC法被广泛应用，多组分同时检测、特殊色谱柱的使用、PDA检测器的推广使用、系统深入的降解研究是今后稳定性指示性HPLC法发展的共同趋势。

4.3 稳定性指示性GC法的应用进展

GC作为稳定性指示性的方法有它的使用局限性，它要求药物容易挥发、热稳定性要好；有时为了增加药物的可挥发性而选择升高温度，将导致某些物质的降解或再次降解。因此，仅有少量的文献报道[19,20]使用GC法用于药物的含量或杂质的测定。

4.4 稳定性指示性CE法的应用进展

毛细管电泳（CE）是以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术，具有高灵敏度、高速度、高分辨率、所需样品少、成本低等优点。

Baalbaki等[21]建立并验证了用于测定异西喷地软膏含量的稳定性指示性的区带毛细管电泳法，药物和内标物在3min内分析完毕，检测限度为0.5mg/L。Hamdan等[22]建立并验证了测定盐酸二甲双胍片含量的稳定性指示性的CE法，通过降解研究结合峰纯度评价，建立了该方法的稳定性指示性的能力。Alnajjar等[23]建立并验证了测定诺氟沙星及其脱羧降解产物含量的稳定性指示性的CE法，对于这两个化合物，分析方法的线性范围较宽，能够达到0.11mg/L的检测限度。中草药的质量控制中也常常用到稳定性指示性的CE法，Song等[24]建立并验证了毛细管区带电泳法测定附子中的6种生物碱含量，通过筛选缓冲溶液体系、pH、有机改性剂、高氯酸的浓度等因素建立了分析方法，并且利用酸、碱、氧化等强制降解因素优化了分析方法。

4.5 其他方法

E1-Bardidy等[25]建立了电化学分析法同时测定对氯苯氧乙酸二甲胺基乙酯盐酸盐和吡硫醇二盐酸盐一水化物的含量，通过降解试验和HPTLC法制备了降解产物，考察了方法的专属性。Badawy等[26]研究了他扎罗汀的稳定性并且建立了两种稳定性指示性的分析方法—一阶导数分光光度法和比光谱导数法，这种方法可以在有其碱性降解产物存在的情况下测定他扎罗汀的含量。

5 展 望

FDA在药品注册申报的批准前现场检查中，经常审核分析方法的专属性问题。检索FDA网站关于“稳定性指示性分析方法”的缺陷信[27]，结果从2001至2010年，共有33份警告信；从2009年至2010年，共10份，结果体现了药政部门对今后分析方法的审核越来越严格。药品质量控制理念在逐步提升，从“药品质量是检验出来的”到“药品质量是生产出来”，再到“药品质量是设计出来的”这一核心转变，伴随着新仪器、新技术的产生，稳定性指示性药物分析方法的应用步入了新的阶段，快速、高专属性、高选择性、高样品处理能力是今后这一领域的发展趋势。

[1]Code of Federal Regulations,Title 21,Volume 4,Revised as of April 1,2010.

[2]FDA,Guidance for industry: Stability testing of drug substances and drug products.Food and Drug Administration,1998.

[3]ICH Q1A (R2) Stability testing of new drug substances and products.International Conference on Harmonization,step 4,2003.

[4]ICH Q2A Text on validation of analytical procedures.International Conference on Harmonization,1994.

[5]ICH Q3B Impurities in new drug products.International Conference on Harmonization,2003.

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[27]FDA.http://www.accessdata.fda.gov/scripts/warningletters/wlSearchResult.cfm?Qry Str=stability+indicating+method&Search=Search.