不同浓度硝酸甘油对心脏缺血/再灌注的作用及ALDH2的作用

王晓梅 李正红 夏满莉 胡 杰 姜翠荣 高 琴 (蚌埠医学院生理学教研室，安徽 蚌埠 233030)

硝酸甘油(nitroglycerin，GTN)在临床应用非常广泛，尤其是治疗心肌缺血相关疾病，如稳定性、不稳定性心绞痛、急性心肌梗死等效果显著，但在治疗慢性心肌缺血方面效果不明确，且长期使用GTN其抗心肌缺血及扩血管效应降低或消失，存在“耐受现象”〔1〕。Chen等〔2〕发现线粒体乙醛脱氢酶2(acetaldehyde dehydrogenase 2，ALDH2)作为一种重要的线粒体氧化还原酶参与硝酸盐类生物活化，提示硝酸盐类耐受可能与ALDH2活性被抑制有关。本实验室在离体大鼠心肌缺血/再灌注损伤模型上观察不同浓度GTN对心肌损伤的作用，进一步分析其机制是否与ALDH2的释放有关。

1 材料与方法

1.1 实验动物和材料 健康雄性 Sprague-Dawley(SD)大鼠体重，200～250 g，清洁级，40只，由蚌埠医学院实验动物中心提供。GTN注射液为北京益民药业有限公司产品。总RNA提取试剂Trizol购自Invitrogen公司;逆转录试剂盒、PCR扩增试剂盒购自Fermentas公司;焦碳酸二乙酯(DEPC)购自上海生工生物工程有限公司;琼脂糖、溴化乙锭(EB)、溴酚兰购自上海生工生物工程有限公司;其余为国产分析纯。改良 Krebs-Henseleit(K-H) 液成分:NaCl 118 mmol/L，KCl 4.7 mmol/L，KH2PO41.2 mmol/L，MgSO41.2 mmol/L，CaCl22.5 mmol/L，NaHCO325 mmol/L，Glucose 11 mmol/L，pH 7.3 ～7.4。ALDH2和β-actin引物由上海生工生物工程有限公司合成。目的基因ALDH2上游引物为5'-GTG TTC GGA GAC GTC AAA GA-3'，下游引物为5'-GCA GAG CTT GGG ACA GGT AA-3'，扩增片段长度187 bp;内参β-actin上游引物为5'-GAT GGT GGG TAT GGG TCA GAA GGA C-3'，下游引物为5'-GCT CAT TGC CGA TAG TGA TGA CT-3'，扩增片段长度630 bp。

1.2 方法

1.2.1 大鼠心肌缺血/再灌注损伤模型复制及分组 雄性SD大鼠断头后开胸，迅速取出心脏，置于4℃ 改良K-H液中，固定于Langendorff灌流装置，K-H液常规恒压(76 mmHg)灌流，以95%O2+5%CO2饱和，维持灌流液温度37℃。将充水乳胶囊由切开的左心耳处插入至左心室，囊内压力经特氟纶管传递至压力传感器，由MedLab生物信号采集处理系统记录和分析。各组心脏均稳定20 min后，局部结扎冠状动脉左前降支模拟缺血30 min，松开结扎线复灌30 min。药物干预组于缺血25 min时给予不同浓度的GTN灌流至复灌初期10 min，灌流共15 min。大鼠随机分为5组，每组8只，各组样本来自同一批动物。(1)正常对照组，大鼠离体心脏K-H液灌流80 min;(2)单纯缺血/再灌注(I/R)组;(3)低浓度GTN组:GTN浓度为1×10－8mol/L;(4)中浓度GTN组:灌流GTN浓度为1×10－7mol/L;(5)高浓度 GTN组:灌流 GTN的浓度为2×10－6mol/L。

1.2.2 左心室功能评价 向插入左心室内的乳胶囊注水使左心室舒张末压(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)维持于4～8 mmHg，记录室内压曲线，测量左心室发展压(Left ventricular developed pressure，LVDP)、室内压最大上升/下降速率(maximal rise/fall rate of left ventricular pressure，dp/dtmax)、LVEDP等心功能指标。

1.2.3 RT-PCR方法检测ALDH2 mRNA表达 采用 Trizol一步法提取左心室心尖部组织总RNA，取总 RNA 3 μg为模板，用随机引物逆转录合成 cDNA，以此 cDNA 1.5 μl为模板，进行PCR扩增。反应条件:95℃预变性3 min后，以95℃ 50 s变性，β-actin退火温度53.4℃ 50 s;ALDH2退火温度59.8℃50 s;72℃ 60 s，反应30个循环，最后一轮延伸10 min。PCR产物判定:取4 μl PCR产物用15 g/L琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭(EB)显色，结果在GIS凝胶图像处理系统中拍摄记录，使用图像分析软件对泳带进行光密度扫描作半定量分析，以目的基因与内参对照的积分吸光度比值(ALDH2/β-actin)表示mRNA相对表达量。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件，结果以±s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析和Newman-Keuls法分析。

2 结果

2.1 左心室血流动力学变化 离体心脏复灌30 min末观察不同组别血流动力学变化。与I/R组比较，低浓度GTN组LVDP增高，±dp/dtmax增高，LVEDP降低;中浓度GTN组各项指标差异无统计学意义;高浓度GTN组LVDP和±dp/dtmax降低，LVEDP增高。见表1。

表1 不同组别再灌注30 min末心室动力学指标改变( ± s，n=8)

表1 不同组别再灌注30 min末心室动力学指标改变( ± s，n=8)

与I/R组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01;下表同

组别 LVDP(mmHg) +dp/dtmax(mmHg/s) -dp/dtmax(mmHg/s) LVEDP(mmHg)I/R组40.5±3.6 1 095.9±204.2 －643.2±56.3 12.4±1.5 10－8mol/L GTN组 72.7±5.62) 2 404.2±384.62) －1 047.3±177.72) 4.9±0.91)10－7mol/L GTN组 47.2±10.9 1 122.4±168.6 －730.2±160.5 18.3±6.5 2×10－6mol/L GTN组 29.1±5.41) 781.3±87.31) －530.9±79.41) 35.8±8.12)

2.2 冠状动脉流出液中LDH含量 与I/R组相比，高浓度GTN组冠脉流出液中LDH释放增加;中浓度GTN组LDH释放相差不大;低浓度GTN组LDH释放减少。见表2。

2.3 心肌ALDH2基因表达的变化 与正常对照组(2.64±0.08)相比，高、中浓度 GTN组(0.89±0.23，1.78±0.11)及 I/R组(1.94±0.06)大鼠心肌ALDH2 mRNA的表达显著降低(P＜0.01);低浓度GTN组(2.77±0.09)差异无统计学意义(P＞0.05)。与I/R组比较，低浓度GTN组心肌ALDH2 mRNA表达均显著升高;高浓度GTN组ALDH2 mRNA表达下降(P＜0.01)。见图1。

表2 离体心脏缺血/再灌注不同时间点冠状动脉流出液中LDH的变化( ± s，n=8)

表2 离体心脏缺血/再灌注不同时间点冠状动脉流出液中LDH的变化( ± s，n=8)

组别 再灌注5 min 再灌注10 min I/R组46.67±4.02 50.67±7.75 10－8mol/L GTN组 18.75±8.542) 22.19±7.592)10－7mol/L GTN组 40.89±5.67 45.68±5.32 2×10－6mol/L GTN组 79.17±6.292) 72.50±5.792)

图1 复灌30 min后各组ALDH2 mRNA表达RT-PCR电泳图

3 讨论

GTN是硝酸酯类扩张血管药物的基础药物，自1876年首次应用于临床，至今已有130多年的历史。GTN可扩张容量血管及阻力血管，选择性扩张心外膜层血管及狭窄的冠状血管以及侧支血管，被广泛应用于治疗慢性心功能不全、室性心肌梗死、心绞痛及高血压等多种疾病与危象。Mackenzie等〔3〕在人体内运用ALDH2抑制剂双硫仑证实抑制ALDH2可部分抑制GTN在人体内的扩血管作用;对ALDH2－/-基因敲除小鼠的研究也表明ALDH2在GTN治疗剂量下的扩张血管中起着重要的和必要的作用〔4〕。不同浓度GTN对心肌缺血/再灌注损伤产生不同的生物学效应。GTN有多种代谢途径，失活或激活亦引发不同的生物学效应。失活途径产生的代谢产物包括无机的亚硝酸盐、硝酸盐以及1，3-二硝酸酯丙三醇(即1，3-GDN)，主要是通过谷胱甘肽还原酶(即GR)和谷胱甘肽-S-转移酶(即GSD)催化完成〔5〕。激活途径的代谢产物包括NO、S-亚硝基硫醇、无机亚硝酸盐及 1，2-二硝酸酯丙三醇(即 1，2-GDN)〔6〕。有研究表明，线粒体内ALDH2是GTN生物活化时的关键酶之一〔7〕。GTN在线粒体中经过ALDH2催化，生成NO或NO相关的中间产物(NOx)、S-亚硝基硫醇、无机亚硝酸盐和1，2-二硝基甘油等物质，其中NOx或S-亚硝基硫醇可能作为活性中间介质激活可溶性鸟苷酸环化酶 (soluble guanyly l cyclase，sGC)，促使组织中的第二信使环鸟苷酸(cGMP)增多。cGMP激活cGMP依赖蛋白，通过调节胞内Ca2+水平调节磷酸化蛋白使血管舒张。ALDH2还可对GTN产生直接的催化作用，水解GTN生成l，2-GDN和NO2，NO2继而进一步转化为NO，发挥舒血管作用。GTN依赖ALDH2激活 cGMP反应〔8〕，如果 ALDH2受到抑制，GTN的血管扩张作用就受到抑制。Chen等〔2〕对在体和离体动物进行实验，观察到抑制ALDH2和敲除ALDH2均减少GTN的活性，提示线粒体ALDH2可激活低浓度GTN(此时GTN浓度为0.1～10×10－6mol/L)活性而发挥生物学效应。GTN耐受性与血管中ALDH2的活性受阻、GTN代谢下降及线粒体产生ROS增多等有关〔9〕。Wenzel报道ALDH2生物激活关键是依赖于使用硝基血管扩张剂药物数量的多少〔10〕。GTN在1～10×10－6mol/L浓度范围内增加导致 1，2-GDN/1，3-GDN 比率逐渐减小，此比率代表着GTN抑制ALDH2转化效率。GTN浓度越大，比率越小(从8降到1)，对ALDH2的抑制作用越强〔8〕。文献报道1×10－6mol/L的GTN对ALDH2的抑制作用相当于ALDH2的抑制剂50×10－6mol/L benomyl或daidzin的作用;均显著降低1，2-GDN/1，3-GDN 比率大约到1〔7〕。大剂量 GTN 同时增加线粒体中活性氧(reactive oxygen species，ROS)的释放，ROS进一步抑制ALDH2的活性，最终表现为大剂量GTN抑制ALDH2的活性〔8〕。本实验在离体大鼠心脏上观察到低浓度的GTN(10－8mol/L)对缺血/再灌注心肌有保护作用，该作用机制可能与低浓度GTN增加ALDH2表达有关;高浓度GTN(10－6mol/L)抑制ALDH2的活性，加重了心脏的损伤作用。不同浓度GTN对离体大鼠心肌损伤产生不同生物学效应，与ALDH2释放量多少密切相关，其临床效果是否与ALDH2活性有关还有待进一步验证。

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