抵抗素基因多态性与中国东北地区汉族老年人群2型糖尿病患病的相关性

孙亚东 马 彦 杨 乐 (吉林省人民医院内分泌科，吉林 长春 130021)

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)主要与胰岛素抵抗和胰岛β细胞分泌胰岛素的功能受损有关。抵抗素作为一种新发现的脂肪组织分泌的肽类激素，成为近年来的研究热点，其功能是对抗胰岛素作用，导致机体胰岛素抵抗。抵抗素的表达受多种因素的调节，如年龄、性别、营养状态、激素、局部因子及药物等〔1〕。因此本文对抵抗素基因在中国东北地区老年T2DM患者中进行单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)进行检测，探讨中国东北地区汉族老年人群中抵抗素基因的多态性与T2DM的相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 所有研究对象均来自于我院内分泌科2009年3月至11月住院患者及体检中心健康体检者，均为中国东北汉族地区老年人群。T2DM组:115例(男59例，女56例)，年龄60～71〔平均(64.28±6.77)〕岁，体重指数(23.1±2.81)kg/m2，诊断符合1999世界卫生组织(WHO)的诊断标准:空腹血糖(FPG)≥7.0 mmo1/L及/或餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L，均除外原发性心肺疾病、脑血管疾病、T2DM大血管并发症以及微血管并发症。正常对照组:99例(男51例，女48例)，年龄60～70〔平均(63.86±6.23)〕岁，均为本院体检中心健康体检者，追问病史、体检、实验室及心电图检查，排除糖尿病、脑血管疾病、心肺疾病及肾脏疾病等。所有入选者抽外周血5 ml，按酚/氯仿法抽提DNA，并首先随机选取其中20例T2DM患者DNA作为筛查SNP的样本。

1.2 方法〔2〕所有入选者抽外周血5 ml，按酚/氯仿法抽提DNA，并首先随机选取其中20例T2DM患者DNA作为筛查SNP的样本。

1.2.1 SNP检测 聚合酶链反应(PCR)在96孔薄壁板中进行。PCR反应体系为25 μl，包含10 ng人基因组 DNA，10×PCR 缓冲液 2.5 μl，25 mmol/L MgCl22 μl，10 mmol/L dNTP 0.5 μl，20 μmol/L 引物 0.4 μl/对，5 U/μl TagDNA 酶 0.2 μl。PCR仪为Prkin-Elmer-Cetus9700。PCR反应条件为酶激活95℃2 min，94℃变性40 s，退火温度在起始的10个循环中为63℃ ～58℃，每次递减0.5℃，反应60 s，延伸72℃ 35 s;在以后的30个循环中，退火温度固定为58℃，每次反应为40 s，延伸72℃35 s;终末延伸72℃ 10 min。序列测定:PCR扩增的目的片段经电泳鉴定、resin(Wizard PCR Preps DNA purification Resin，Promega)纯化后，用ABlPRIMERTM，Big-Dye末端标记试剂盒(PE，Foster City，CA)，以PCR反应的特异引物为测序引物进行双向测序反应。测序反应条件:96℃变性10 s，50℃退火5 s，60℃延伸4 min，35个循环。产物经乙醇沉淀，ABI377自动测序仪行核苷酸序列测定。并进一步用PolyPhred软件对测序结果进行分析，综合正反双向序列结果识别SNP。

1.2.2 SNP的基因分型 对所筛查出的SNP采用直接测序法对所有受试者作进一步基因分型。

1.3 统计学方法 采用SAS软件，计算两组SNP位点的等位基因频率，组间差异分析采用χ2检验。

2 结果

2.1 抵抗素多态性分析 抵抗素基因共测序2 813 bp，共检出5个SNPs，均在启动子区。

2.2 SNP等位基因频率在T2DM组与正常对照组比较 采用直接测序法在T2DM患者和99例正常对照者间作进一步基因分型，结果表明这些SNP的等位基因频率在两组之间均无显著性差异(P＞0.05)。见表1。

表1 抵抗素基因SNPs在T2DM组和正常对照组间等位基因频率比较(%)

3 讨论

T2DM患病率逐年提高，死亡率亦逐年增加，深入探索其发病机制对于糖尿病血管病变的综合防治、提高糖尿病患者的生存率和生存质量有重要的理论和实践意义。遗传因素在其中可能起着相当重要的作用，故探讨遗传基因多态性与T2DM并发症发生发展的关系成为近年研究热门〔3～5〕。

抵抗素与胰岛素抵抗、糖尿病、炎症、动脉粥样硬化(AS)等病理过程或疾病有关，但其具体作用还不很明确。人抵抗素基因定位于19p13.3，内含子边界序列均高度保守。其mRNA含476个碱基，迄今仅发现2种人抵抗素亚型。最近研究表明，抵抗素蛋白晶体具有独特的多聚体结构:每个单体尾端由二硫键相连，形成三聚体或四聚体结构，此二硫键形成可能是抵抗素活化的必需步骤之一。抵抗素二聚体具有全蛋白80% ～90%的功能，而抵抗素单体仅有全蛋白10% ～20%的功能。抵抗素的装配与调节机制迄今尚不明确，推测可能对二硫键的剪切或装配过程的调节来调节抵抗素的剪切与装配〔6〕。

有研究发现糖尿病微血管病变患者与单纯T2DM病患者的血浆抵抗素水平均显著高于正常对照组〔7〕。而亦有研究认为血清抵抗素可能与T2DM的发病不相关〔2〕。本研究采用直接测序法在T2DM和正常对照组间进行基因分型及等位基因频率比较，共检测5个SNP，结果显示在上述两组东北地区汉族老年人群中这此SNP的等位基因频率无显著性差异，表明抵抗素基因多态性与东北地区汉族T2DM老年人群中无显著相关性，这可能与研究样本的数量、位点的选取及不同种族间的糖尿病易感性及个体差异有关。

本研究认为抵抗素基因多态性与中国东北地区汉族人群老年T2DM无显著相关性。

1 孙 祯，李希圣.抵抗素与肥胖及2型糖尿病相关性研究〔J〕.医学综述，2009;15(11):1693-5.

2 董 艳，黄 微，李 果，等.抵抗素基因多态性与华东地区2型糖尿病的相关性〔J〕.上海第二医科大学学报，2003;23(2):97-9.

3 Patel SD，Rajala MW，Rosseui L，et al.Disulfide-dependent multimeric assembly of resistin family hormones〔J〕.Science，2004;304(5674):1154-8.

4 Arita Y，Kihara S，Ouchi N，et al.Adipocyte-derived plasma protein adiponectin acts as a platelet-derived growth factor-BB-binding protein and regulates growth factor-induced common postreceptor signal in vascular smooth muscle cel〔J〕.Circulation，2002;105(24):2893-8.

5 Qi L，Doria A，Manson JE，et al.Adiponectin genetic variability，plasma adiponectin，and cardiovascular risk in patients with type 2 diabetes〔J〕.Diabetes，2006;55(5):1512-6.

6 徐伟斌，俞 璐，罗 敏.抵抗素的研究进展〔J〕.国际内分泌代谢杂志，2006;26(1):23-5.

7 庄 玮，成兴波.血浆抵抗素与2型糖尿病及糖尿病微血管病变关系的研究〔J〕.中国血液流变学杂志，2006;16(1):101-3.