压力负荷诱导大鼠心肌重塑早期左室舒张功能评价*

盖迎利，徐 明，白 燕，肖 晗，马晓伟，吕志珍，冯杰莉，张幼怡，李昭屏

(北京大学第三医院心内科，卫生部心血管分子生物学与调节肽重点实验室，北京 100191)

舒张性心力衰竭是严重威胁人类健康的重要疾病[1，2]，而高血压是引起这一疾病的最常见病因[3]。深入研究舒张功能障碍的发生机制和寻找敏感而准确的舒张功能评价指标，对舒张性心力衰竭的早期诊断和治疗至关重要。制备并准确评价心肌肥厚及左室舒张功能异常动物模型是探讨舒张性心力衰竭发病机制的基础。我们通过建立压力负荷诱导大鼠心肌重塑模型，对其从心肌肥厚到舒张功能减退的全过程进行系统而全面的评价，以探讨大鼠心肌重塑早期左室舒张功能异常的评价方法。

材料和方法

1 压力负荷诱导大鼠心肌重塑模型制备

选用3周龄SD雄性大鼠，体重45-55 g，由北京大学医学部实验动物中心提供。按照随机原则将动物分为4组:主动脉缩窄3周组和6周组，主动脉缩窄假手术3周组和6周组，每组各6只。采用横向主动脉缩窄(transverse aortic constriction，TAC)方法[4]建立压力负荷心肌重塑模型，假手术组除不缩窄主动脉外，其余步骤与手术组相同。

2 超声心动图检测

术后每周对大鼠进行超声心动图检测，连续、动态观测心脏结构及功能的变化。采用Vevo770小动物超声仪，探头频率为17.5 MHz。大鼠吸入3%-4%异氟烷基础麻醉[5]后，刮去胸前体毛，仰卧位固定于恒温加热板上，持续吸入1%-2%异氟烷，四肢与心电图电极相连用于监测心率并记录心电图，超声心动图各参数连续测量5个心动周期，计算均值。

2.1 左室结构检测及心肌重量评估 探头置于大鼠胸骨前，二维超声显示左室短轴切面，于乳头肌水平应用M型超声记录左心室运动曲线，测量左室舒张末期内径(left ventricular internal diameter at enddiastole，LVIDd)和收缩末期内径(left ventricular internal diameter at end-systole，LVIDs)、舒张末期左室前壁厚度(left ventricular anterior wall thickness，LVAWd)和左室后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness，LVPWd)，计算左心室重量{left ventricular mass，LVM=1.05 × [(LVIDd+LVPWd+IVSd)3-LVIDd3]×0.8}和左室短轴缩短率[left ventricular fractional shortening，FS%=(LVIDd-LVIDs)/LVIDd×100%]。

2.2 二尖瓣血流频谱测定 二维超声清楚显示心尖四腔心切面，取样容积置于二尖瓣瓣尖水平，采用脉冲多普勒测定二尖瓣舒张早期峰值血流速度(E)和舒张晚期峰值血流速度(A)，计算E/A，测量E波减速时间(E-wave deceleration time，DT)，见图1。

2.3 左室后壁心肌运动速度测定 参照文献[6]方法显示左室心尖长轴切面组织多普勒速度模式，将取样容积置于左室后壁乳头肌水平，测定收缩期心肌运动速度(S')、舒张早期心肌运动速度 (E')、舒张晚期心肌运动速度(A')，见图2。

Figure2.Tissue Doppler imaging detected from left ventricular posterior papillary muscle level.E':early diastolic myocardial tissue velocities;A':late diastolic myocardial tissue velocities;S':systolic myocardial tissue velocities.图2 乳头肌水平左室后壁心肌组织多普勒频谱

3 有创血液动力学检测

参照文献[7]方法，对TAC术后3周和6周大鼠超声心动图检测后行左室插管血液动力学测定。采用2.0 F Millar导管经右侧颈总动脉逆行插入左心室，稳定后记录左心室收缩压(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左心室舒张末压(left ventricular end diastolic pressur，LVEDP)、左心室压力最大和最小上升速率(dp/dtmax和 dp/dtmin)，并计算 dp/dtmin/LVSP[8]。

4 心脏大体解剖参数测量

有创血流动力学检测后处死大鼠，迅速取出心脏，称量左心室重量(anatomy left ventricular mass，Anat LVM)，计算左心室重量/胫骨长度(anatomy left ventricular mass/tibia length，Anat LVM/TB)。剪取部分左心室游离壁心肌行组织切片检查。

5 心脏组织切片及染色

将所取左室游离壁心肌进行天狼星红染色，观察心肌组织中胶原的变化。

6 心肌组织中羟脯氨酸含量测定

参照文献[9]方法，利用羟脯氨酸(hydroxyproline)检测试剂盒(南京建成生物医药公司提供)，检测每g湿重心肌组织中羟脯氨酸含量(μg)，即μg/g湿重。

7 统计学处理

结 果

1 超声心动图检测结果

1.1 超声心动图左室结构检测结果 小动物超声仪可清晰显示大鼠心脏结构，并能够获得满意的M超左室运动曲线。TAC术后3周及6周LVAWd、LVPWd均明显大于相应假手术组(P＜0.01)，而LVIDd在同龄TAC组与假手术组间无显著差异;由超声心动图估算的Echo LVM/BW在TAC组也明显大于假手术组(P＜0.01)，见表1。

表1 主动脉缩窄组和假手术组大鼠超声左室结构参数比较Table1.Comparison of left ventricular structure between transverse aortic constriction group and sham-operated group by echocardiographic measurements(E.n=6)

表1 主动脉缩窄组和假手术组大鼠超声左室结构参数比较Table1.Comparison of left ventricular structure between transverse aortic constriction group and sham-operated group by echocardiographic measurements(E.n=6)

LVAWd:left ventricular anterior wall thickness;LVPWd:left ventricular posterior wall thickness;LVIDd:left ventricular internal diameter at end-diastole;LVM/BW:left ventricular mass/body weight;HR:heart rate.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs sham group.

Parameter LVAWd(mm) LVPWd(mm) LVIDd(mm) LVM/BW HR(min-1)3 weeks Sham 1.43±0.06 1.44±0.02 7.07±0.16 2.308±2440±0.10 307±20 TAC 1.71±0.11＊＊ 1.78±0.03＊＊ 7.45±0.13 3.51±0.20* 310±176 weeks Sham 1.65±0.07 1.72±0.03 7.60±0.18 2.39±0.20 305±31 TAC 2.21±0.17＊＊ 2.30 ±0.09＊＊ 7.68±0.28 4.02±0.10＊＊

1.2 超声心动图左室功能结果 TAC术后3-6周，舒张早期左室后壁心肌运动速度E'显著低于假手术组(P＜0.01);二尖瓣E/A及DT在TAC组与假手术组间无显著差异;FS在两组间无显著差异，见表2。

表2 主动脉缩窄组和假手术组大鼠超声左室功能指标比较Table2.Comparison of left ventricular function between transverse aortic constriction group and sham-operated group by echocardiographic measurements(E.n=6)

表2 主动脉缩窄组和假手术组大鼠超声左室功能指标比较Table2.Comparison of left ventricular function between transverse aortic constriction group and sham-operated group by echocardiographic measurements(E.n=6)

E/A:ratio of left ventricular peak E-wave velocity to atrial peak flow velocity;DT:mitral E-wave deceleration time;E':early diastolic myocardial tissue velocities;FS%:left ventricular fractional shortening.＊＊P ＜0.01 vs sham group.

Parameter E/A DT(ms) E'(mm/s) FS(%)3 weeks Sham 1.6±0.1 24.5±2.0 63.8±1.5 46.5±1.1 TAC 1.7±0.2 23.5±1.7 52.1±0.8＊＊ 46.1±1.16 weeks Sham 1.7±0.1 26.0±1.7 69.7±1.6 47.0±4.1 TAC 1.7±0.1 25.1±2.2 48.5±2.6＊＊44.1±2.6

2 有创血流动力学检查结果

术后3周心导管检测，TAC组大鼠LVSP显著高于假手术组(P＜0.05)，6周时进一步增加(P＜0.01)。dp/dtmax、dp/dtmin、LVEDP 在 TAC 组和假手术组间无显著差异;但经LVSP校正后的左室舒张功能评价指标dp/dtmin/LVSP在术后3周有下降的趋势(48.9±5.9 vs 63.5±9.9);术后6周显著下降(P＜0.05)，见表3。

3 心脏解剖称重结果

TAC术后 3周和 6周时的 Anat LVM、Anat LVM/TB均显著大于假手术组(P＜0.01)，见表4。主动脉缩窄术后3周及6周大鼠Anat LVM和超声心动图估算的左心室重量(echocardiographic left ventricular mass，Echo LVM)高度相关，r=0.90，P ＜0.01，见图3。

表3 TAC组和假手术组大鼠血流动力学指标比较Table3.Comparison of hemodynamic measurements between transverse aortic constriction group and sham-operated groups(E.n=5)

表3 TAC组和假手术组大鼠血流动力学指标比较Table3.Comparison of hemodynamic measurements between transverse aortic constriction group and sham-operated groups(E.n=5)

LVSP:left ventricular systolic pressure;dp/dtmax:maximum rate of rise of left ventricular pressure;dp/dtmin:maximum rate of degression of left ventricular pressure;LVEDP:left ventricular end diastolic pressure;dp/dtmin/LVSP:corrected value of dp/dtminby LVSP.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs sham group.

Parameter LVSP(mmHg) dp/dtmax(mmHg·s-1)dp/dtmin(mmHg·s-1) dp/dtmin/LVSP LVEDP(mmHg)3 weeks Sham 104.6±4.0 8404±556 6510±841 63.56.3±1.7±9.9 4.9±0.5 TAC 131.6±10.4* 8011±765 6501±520 48.9±5.9 3.5±1.76 weeks Sham 99.6±5.8 6438±699 5368±261 54.4±2.9 3.1±1.2 TAC 180.9 ±16.8＊＊ 7025 ±786 5913 ±676 35.4 ±4.0＊＊

Figure3.Correlation of left ventricular anatomic weight and ultrasound assessment mass.Anatomy LVM:anatomy left ventricular mass;Echo LVM:echocardiographic left ventricular mass.图3 左心室解剖称重和超声评估相关性

表4 TAC组和假手术组大鼠左室重量与胫骨长度之比Table4.The ratio of left ventricular mass to tibia length in TAC rats and sham-operated controls(E.n=6)

表4 TAC组和假手术组大鼠左室重量与胫骨长度之比Table4.The ratio of left ventricular mass to tibia length in TAC rats and sham-operated controls(E.n=6)

LVM:left ventricular mass;TB:tibia length;LVM/TB:left ventricular mass/tibia length. ＊＊P ＜0.01 vs sham group.

Parameter LVM(mg) TB(mm) LVM/TB(mg·mm-1)3 weeks Sham 536±18 35.7±0.6 14.8±0.6 TAC 689 ±33＊＊ 34.2 ±0.8 19.6 ±1.1＊＊6weeks Sham 657±38 41.3±0.4 15.6±0.7 TAC 943±43＊＊ 40.5±0.7 23.2±0.9＊＊

4 组织形态学改变

显微镜下观察，天狼星红染色示心肌组织呈黄色，胶原呈红色。术后3周TAC组可见血管周围胶原沉积明显增多，6周时胶原增加更显著，且呈弥漫性改变，见图4。

Figure4.Comparison of histomorphological changes in rat heart.A and C:3 and 6 weeks after sham operation;B and D:3 and 6 weeks after transverse aortic constriction.Increased collagen was seen in B and D(Sirius red staining，×200).图4 心脏组织形态学变化比较

5 心肌组织中羟脯氨酸含量

TAC组3周左室心肌组织中羟脯氨酸含量与假手术组相比未见显著变化[(382.1±19.3)μg vs(354.7±7.9)μg，P ＞0.05]，6周时 TAC 组左室心肌中羟脯氨酸含量显著高于假手术组[(465.3±17.3)μg vs(351.4 ±8.2)μg，P ＜0.05]，见图5。

Figure5.The content of hydroxyproline in myocardial tissues.E.n=6.#P＜0.05 vs 3 weeks TAC group;*P＜0.05 vs sham group.图5 左室心肌组织中羟脯氨酸含量

讨 论

在基础实验研究中，敏感而准确地评价动物模型制作是否成功，并筛选出一致性好的模型，是确保实验能够顺利进行和实验数据可靠的重要基础。我们利用高频小动物超声仪连续观测压力负荷引起大鼠心肌重塑过程，显示主动脉缩窄术后3周大鼠左室前壁和左室后壁厚度均高于假手术组，而左心室舒张末内径在两组无差异，提示手术组大鼠心肌出现了向心性肥厚，术后6周这种心肌肥厚继续维持。由超声心动图估测的左心室重量在手术组也明显高于假手术组，且与解剖称重的左室重量有良好的一致性(r=0.90，P＜0.01)，提示高频小动物超声仪可以无创、准确、敏感地评价压力负荷诱导的大鼠左心室肥厚。心肌组织中羟脯氨酸的含量可以反映胶原的蛋白表达水平，TAC术后组织病理显示胶原含量增加以及心肌组织中羟脯氨酸含量增加均提示主动脉缩窄组大鼠发生了心肌纤维化，这从组织形态学水平证实了压力负荷大鼠发生了心肌重塑，验证了压力负荷大鼠模型制作成功。

超声心动图因其无创、可重复性的特点，已经广泛应用于临床患者心功能的检测，近年来也逐渐渗透到基础研究中动物模型的心功能评价。临床上常用的左室收缩功能指标是LVFS，左室舒张功能指标是多普勒超声心动图测得的二尖瓣舒张期血流频谱E/A和E峰减速时间，但这些指标反映的是心室前后负荷、心肌收缩力和心率等多种因素的综合结果，并不适于心肌的收缩及舒张能力的评价。脉冲组织多普勒通过对局部心肌的实时速度追踪，能够定量地评价心肌运动，与有创血流动力学指标有良好的相关性，比传统的舒张功能评价指标(二尖瓣血流E/A)更能准确而敏感地评价舒张功能[10-12]。但这一技术在小动物实验研究中应用得还很少。由于小动物心率较快，普通超声心动图难以显示清晰的二尖瓣血流频谱和组织多普勒频谱，故对其心脏舒张功能评价受到限制。目前尚无在清醒状态下研究小动物舒张功能的报道，即使经过严格训练，能够在清醒状态下配合进行超声检测的小鼠，也会由于心率较快，现有的超声检测技术无法区分舒张早期和舒张晚期的心肌运动图谱，只能看到心脏舒张期组织运动的融合波[13]。麻醉剂的应用会影响到动物的舒张功能，这主要是由于不同的麻醉方法和麻醉时间的长短直接影响动物的心率，进而影响心脏的舒张功能[13]，麻醉过深过久，导致心率严重减慢，会影响心功能检测的准确性。我们的研究采用异氟烷吸入1 min内即能快速诱导麻醉，并利用Vevo770小动物超声仪高频探头(17.5 MHz)的特性，可以清晰地获得二尖瓣舒张期早期和舒张晚期的血流频谱及左室后壁心肌运动速度。检测过程中可控给予维持浓度异氟烷吸入来平稳地控制大鼠心率在270-330 bpm，超声检测在5 min之内完成，大鼠在超声检测结束后1 min内即可苏醒，最大限度地减少了麻醉对心脏功能的影响。我们没有进一步研究不同心率状态下心脏舒张功能的变化，但实验组与对照组比较心率无显著差异，两组具有可比性。我们的研究可以为小动物舒张功能的评价及机制探讨提供可靠帮助。

本研究中传统的舒张功能评价指标E/A和DT以及收缩功能指标FS在术后3周和6周相应TAC组和假手术组之间没有显著差异(P＞0.05)，而组织多普勒检测的左室后壁心肌运动速度(E')在TAC组术后3周就出现明显降低[(52.1±0.8)mm/s vs(63.8±1.5)mm/s，P ＜0.01]，提示主动脉缩窄术后3周大鼠左室整体收缩和舒张功能尚正常的情况下，局部心肌已出现舒张功能障碍。这种心肌舒张功能减退同时被有创的血流动力学检查证实:dp/dtmin为等容舒张期心室内压力下降最大速率，但其明显受到主动脉瓣关闭时心室内压力的影响，故用dp/dtmin/LVSP来校正以更准确地反映心肌舒张功能[8]，dp/dtmin/LVSP在TAC组术后3周就有下降趋势，术后6周进一步降低，与假手术组相比有显著差异。

综上所述，超声心动图的组织多普勒技术可以准确、无创而敏感地评价主动脉缩窄法压力负荷诱导的大鼠心肌重塑模型早期左室舒张功能的改变，心肌肥厚和心肌组织纤维化是心肌舒张功能减退的病理基础。

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