血卟啉对人胰腺癌细胞Panc－1的光动力作用及机制*

于 钟， 钟 娃， 袁宇红， 陈其奎， 朱兆华△， 张晋昕

(1中山大学孙逸仙纪念医院消化科，广东 广州 510120;2中山大学医学统计与流行病学系，广东 广州 510080)

迄今为止，胰腺癌仍是所有常见恶性肿瘤中生存率最低者，仅10%的患者在就诊时有手术机会［1］，对无法手术的患者，可能有效的措施是化疗、放疗或二者的结合。目前总的1年生存率不超过10%［2］，新治疗方法仍亟待解决。

光动力治疗(photodynamic therapy，PDT)是二十世纪80年代发展起来的一种肿瘤治疗新方法，其原理是利用光敏剂能够选择性聚集在肿瘤组织中，然后用特定波长的激光激发光敏剂，使其产生光化学和光生物学反应，破坏肿瘤组织［3］。本研究以人胰腺导管细胞癌Panc－1细胞系为对象，系统观察了光敏剂Photosan(即血卟啉，hematoporphyrin)PDT对体外培养的人胰腺癌细胞的杀伤效应，并探讨其主要作用机制。

材料和方法

1 主要试剂及仪器

人胰腺癌细胞系Panc－1购于美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection，ATCC)，并由我院医学研究中心冻存。Photosan冻干粉针(145 mg/支，购自 SeeLab);CCK－8(Cell Counting Kit－8，日本同仁化学研究所);活性氧检测试剂盒、细胞坏死与凋亡检测试剂盒(均购自碧云天生物技术研究所);兔抗鼠活性caspase－3多克隆抗体(Abcam)。Biolitec PDT 630半导体激光治疗仪(CeramOptec GmbH);流式细胞仪 (FACS Calibur，Becton Dickinson);组合式荧光寿命与稳态荧光光谱仪(英国爱丁堡仪器公司)。

2 人胰腺癌细胞株Panc－1的体外培养

参照司徒镇强［4］介绍的方法进行。Panc－1细胞常规复苏后在RPMI－1640完全培养基(含青霉素1×105U/L、链霉素100 mg/L、10%新鲜胎牛血清)中培养，细胞培养密度为(1－2)×109/L，每3－4 d传代1次，取对数生长期用于实验。

3 光敏剂Photosan溶液的准备

每于实验前根据实验所需称取Photosan冻干粉，用不含血清的RPMI－1640培养基配制成不同浓度的溶液，保存于4℃备用。所有操作过程及保存均在避光条件下进行。

4 光敏剂Photosan对Panc－1细胞的PDT作用

4.1 PDT 配制光敏剂为如下浓度:0.5、1、2、3、4、6、8、10、12 mg/L，并设不加光敏剂的空白对照(0 mg/L)。设光照剂量如下:1、5、10、15、20、25、30 J/cm2，并设不予照射的空白对照(0 J/cm2)。实验设3个复孔。调整Panc－1细胞密度为5×107/L，接种于96孔板，每孔100 μL，培养24 h，使细胞贴壁。更换细胞培养基为上述各种浓度的光敏剂100 μL/well，培养8 h。再更换光敏剂溶液为不含血清的培养基100 μL/well，立即给予激光照射，波长630 nm、光斑直径5 cm。为避免光线散射或反射的影响，每板只接受1次激光照射。照射完毕，所有96孔板继续培养24 h。

4.2 PDT后CCK－8实验测定Panc－1细胞活性(1)原理:CCK－8试剂中含有WST－8，它在电子载体1－methoxy PMS的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜染料。生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比，因此可以酶标仪检测其吸光度进行细胞毒性分析［5］。(2)方法:取出所有96孔板，每孔加入10 μL的CCK－8，轻微振荡混匀10 min，置培养箱孵育4 h后取出，以酶标仪检测各组各孔吸光度值，每板用一空白孔调零。检测波长为450 nm，参比波长为630 nm。各组吸光度(A450)可以转换为细胞存活率(%):［(实验孔A450－调零孔A450)/(对照孔A450－调零孔A450)］×100%。上述实验重复3次，所有操作过程均在避光条件下进行。

5 光敏剂Photosan对Panc－1细胞PDT作用的机制

5.1 PDT后Panc－1细胞内活性氧(reactive oxidative species，ROS)的测定

①荧光显微镜观察Panc－1细胞内活性氧 原理:荧光探针2’，7’－二氯荧光黄双乙酸盐(DCFHDA)可自由进入细胞，被细胞内的酯酶水解生成DCFH。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF，检测DCF的荧光就可以反映细胞内活性氧的水平［6］。方法:配制光敏剂为如下浓度:1、4、8、10 mg/L，并设不加光敏剂的空白对照(0 mg/L)。光照剂量如下:1、5、10 J/cm2，并设不予照射的空白对照(0 J/cm2)。PDT治疗同4.1。PDT后1 h用无血清培养基稀释DCFH－DA为10 μmol/L，并更换各孔培养基，100 μL/well，置培养箱孵育30 min，用无血清培养基洗涤细胞3次，置于荧光显微镜下观察并照片。根据说明书提供的DCF激发波长488 nm，发射波长525 nm，选择蓝色激发光，观察绿色荧光。

②流式细胞仪测定Panc－1细胞内活性氧 光照剂量和光敏剂浓度的设置、PDT治疗、装载荧光探针DCFH－DA均同①。试验中Panc－1细胞接种于12孔板，密度为1×108/L，1 mL/well。实验完毕，收集各组各孔细胞，1000 r/min离心5 min，PBS洗涤、重悬后，以流式细胞仪测定DCF相对荧光强度。

5.2 流式细胞仪检测PDT后Panc－1细胞凋亡及坏死 Panc－1细胞接种于直径6 cm培养皿，一组照射功率5 J/cm2，光敏剂浓度为 0、2、4、6、8、10、12 mg/L;另一组光敏剂浓度 4 mg/L，照射功率为 0、5、15、20、25。PDT治疗同上方法4.1，PDT后24 h收集各组细胞以流式细胞仪检测各组细胞凋亡和坏死的比率。

5.3 Western blotting检测 PDT后 Panc－1细胞caspase－3活性蛋白水平 细胞标本分组如下(包括不加光敏剂且不予照射的空白对照)，见表1。

表1 Western blotting实验细胞标本分组Table 1.Cell sample groups of Western blotting test

接种细胞于直径6 cm培养皿，PDT方法同上方法4.1，PDT后24 h收集各组细胞，以Western blotting检测细胞caspase－3活性蛋白水平。将X光片用凝胶成像系统在白光下扫描后，应用Image－Pro Plus 6.0专业图像分析软件进行吸光度分析。实验重复3次。

6 统计学处理

结 果

1 光敏剂Photosan对Panc－1细胞的PDT效应及其影响因素

PDT后24 h CCK－8实验测得调零孔A450为0，各实验组及对照组的A450见表2。各孔的细胞存活率见图1。

统计显示，光敏剂浓度0.5－10 mg/L时，细胞存活率总体随浓度增加而明显下降;10 mg/L以上，细胞存活率不再显著下降;光照剂量1－20 J/cm2时，细胞存活率总体随剂量增加而明显下降，20 J/cm2以上，细胞存活率不再显著下降。单纯给予光敏剂(0 J/cm2)或光照(0 mg/L)，细胞存活率均不受影响，见图1。光敏剂浓度和光照剂量之间存在交互作用(P＜0.05)。进一步以交互参数进行统计推断［7］:将代表此二因素交互作用的变量“光敏剂浓度×光照剂量”与A450进行线性回归，得到回归系数β=－0.421(P＜0.05)，表明二者之间为协同作用。

表2 人胰腺癌细胞株Panc－1经不同浓度光敏剂和不同剂量光照后的A450值Table 2.The A450values of Panc－1 cells treated with different concentrations of photosensitizer and different doses of light(.n=3)

表2 人胰腺癌细胞株Panc－1经不同浓度光敏剂和不同剂量光照后的A450值Table 2.The A450values of Panc－1 cells treated with different concentrations of photosensitizer and different doses of light(.n=3)

Photosan concentration(mg/L)Light dose(J/cm2)1.411 ±0.0200.5 1.401±0.040 1.341±0.130 1.330±0.090 1.207±0.130 1.109±0.030 1.108±0.030 1.066±0.030 1.065±0.04011.412±0.090 1.282±0.090 1.198±0.060 1.083±0.050 1.033±0.050 1.002±0.080 0.984±0.060 0.981±0.0402 1.419±0.080 1.254±0.040 1.125±0.090 0.924±0.090 0.995±0.070 0.902±0.070 0.944±0.040 0.924±0.06031.401±0.030 1.258±0.080 1.079±0.060 0.655±0.050 0.863±0.040 0.682±0.050 0.735±0.030 0.793±0.00041.354±0.040 1.200±0.060 0.932±0.100 0.532±0.050 0.562±0.060 0.549±0.040 0.403±0.040 0.438±0.03061.410±0.060 1.197±0.040 0.709±0.060 0.356±0.090 0.212±0.020 0.214±0.010 0.182±0.020 0.206±0.02081.388±0.040 1.110±0.050 0.404±0.040 0.149±0.010 0.121±0.010 0.118±0.010 0.108±0.010 0.118±0.01010 1.367±0.040 0.943±0.050 0.215±0.020 0.107±0.010 0.110±0.010 0.104±0.090 0.099±0.010 0.098±0.01012 1.393±0.050 0.931±0.070 0.164±0.010 0.107±0.020 0.124±0.030 0.124±0.030 0.102±0.0110 15 20 25 3001.415±0.020 1.413±0.020 1.411±0.010 1.409±0.020 1.409±0.020 1.416±0.030 1.415±0.0200150 0.096 ±0.010

Figure 1.Viability of Panc－1 cells treated with different concentrations of photosensitizer and different doses of light.图1 人胰腺癌细胞株Panc－1经不同浓度光敏剂和不同剂量光照后的细胞存活率

2 光敏剂Photosan对人胰腺癌Panc－1细胞PDT作用的机制

2.1 PDT后Panc－1细胞内活性氧的测定

①荧光显微镜观察Panc－1细胞内活性氧 随光敏剂浓度以及光照剂量的增加，活性氧阳性细胞数量增加，且荧光强度相应增强，见图2。

②流式细胞仪测定Panc－1细胞内活性氧 光照剂量为5 J/cm2时，各浓度组细胞内活性氧的相对荧光强度见图3;光敏剂浓度为4 mg/L时，各光照剂量组细胞内活性氧的相对荧光强度见图4。统计显示，随光敏剂浓度的增加，以及随光照剂量的增加，细胞内活性氧均逐渐增多(P＜0.05)。

Figure 2.ROS production in Panc－1 cells after PDT(fluorescence microscope，×40).A:Photosan 0 mg/L，light dose 0 J/cm2(control);B:Photosan 4 mg/L，light dose 1 J/cm2;C:Photosan 8 mg/L，light dose 5 J/cm2;D:Photosan 10 mg/L，light dose 5 J/cm2.图2 PDT后Panc－1细胞内活性氧阳性细胞数量

Figure 3.Impact of Photosan concentration on intracellular ROS production(light dose=5 J/cm2).图3 光敏剂浓度对细胞内活性氧的影响

Figure 4.Impact of light dose on intracellular ROS(Photosan concentration=4 mg/L).图4 光照剂量对细胞内活性氧的影响

2.2 流式细胞仪检测PDT后Panc－1细胞凋亡及坏死 光照剂量为5 J/cm2时各浓度组的细胞凋亡率和坏死率，以及光敏剂浓度为4 mg/L时各光照剂量组的细胞凋亡率和坏死率见图5、6。

Figure 5.Rates of apoptosis and necrosis in groups of Photosan concentration when light dose was 5 J/cm2.*P ＜0.05 vs necrosis group.图5 光照剂量为5 J/cm2时各光敏剂浓度组的细胞凋亡率和坏死率

Figure 6.Rates of apoptosis and necrosis in groups of light dose when Photosan concentration was 4 mg/L.*P ＜0.05 vs necrosis group.图6 光敏剂浓度为4 mg/L时各光照剂量组的细胞凋亡率和坏死率

统计显示，当光照剂量恒定时，细胞凋亡率和坏死率均随光敏剂浓度增加而增加;当光敏剂浓度恒定时，凋亡率和坏死率均随光照剂量增加而增加，但两种情况下均表现凋亡率＞坏死率(P＜0.05)，表明细胞的损伤以凋亡为主。

2.3 Western blotting检测 PDT后 Panc－1细胞caspase－3活性蛋白水平 结果见图7。PDT后与PDT前(1)比，caspase－3水平明显增强。并且随光敏剂浓度增加(2－6)、随光照剂量增加(7、4、8)，caspase－3水平相应增强(P＜0.05)。

Figure 7.Expression of activated caspase－3 protein in Panc－1 cells after PDT detected by Western blotting.图7 Western blotting检测PDT后Panc－1细胞caspase－3蛋白表达

讨 论

1 血卟啉光动力治疗对人胰腺癌细胞Panc－1的效应及其影响因素

实验结果结合统计分析显示:光动力治疗对Panc－1细胞具有明确的杀伤效应。但是，单纯给予光敏剂或单纯进行光照，则无PDT效应，说明光敏剂和特定波长的光照是光动力杀伤肿瘤细胞作用中缺一不可的重要因素，这符合光动力治疗的基本特点［8］。同时也提示:光敏剂或相应波长的激光，并不具备独立的生物学效应，正常组织单独接触时可能是安全的。

研究发现，随着光敏剂浓度和光照剂量的增加，PDT对细胞杀伤作用相应增强，当光敏剂达到10 mg/L，光照剂量达到15 J/cm2时，这一作用趋向达到最大。对此的解释是:(1)由于光敏剂浓度对PDT效应的影响是通过细胞内光敏剂含量产生的。而细胞内光敏剂含量取决于细胞对其的摄取和“排泄”［9］过程，在光敏剂浓度较低时，细胞对其摄取超过排泄，当浓度增加到一定程度，摄取与排泄达到动态平衡，这时表现出细胞内光敏剂的“饱和”现象。(2)另一个影响光敏剂效应的因素是荧光猝灭现象，这是指荧光物质分子与溶剂分子之间或其自身分子之间发生的相互作用导致荧光强度减弱或消失的现象［10］。由于Photosan中大卟啉环之间的堆叠作用(称为π－π堆积)，将导致分子之间的荧光猝灭而削弱其光敏活性，并随浓度增高而逐渐明显［11］。(3)这也可能与细胞内参与结合与转运光敏剂的受体已全部动员有关。光照剂量对PDT效应的影响则与其所引发光敏剂产生的光化学反应随照射能量的逐渐增大最终达到“饱和”有关。

另外，结果还发现，光敏剂浓度与光照剂量之间存在交互作用。为进一步明确该交互作用的类型及其影响，我们进行了交互系数的统计推断。当该系数β≠0时，表示存在光敏剂浓度和光照剂量之间的交互作用，而β的正负则表示交互作用对因变量的作用是增强还是减弱［7］。经计算得到β=－0.421，表明光敏剂浓度和关照剂量的交互作用是协同降低细胞存活率。这一现象的原因尚不清楚，但对临床工作可能提供有意的指导。比如，为提高疗效可以通过增加少许光照剂量而不必投入更多的光敏剂，从而减少大剂量光敏剂对皮肤光敏损伤等副作用的风险以及荧光猝灭现象的不利影响;而且增加光照剂量几乎不需增加费用，但光敏剂的增加将显著增加病人的经济负担。曾有学者认为光敏剂浓度和光照剂量之间并无明显互惠作用，原因之一可能是光照对光敏剂的破坏而使其消耗，该现象称为光漂白(photobleaching)［12］。而由于光漂白效应与光敏剂自身特性及其所处的体系有很大关系，因此尚需更多的研究来探讨光漂白对光敏剂浓度和光照剂量之间关系的影响。

2 光敏剂Photosan对人胰腺癌Panc－1细胞PDT作用的机制

光动力对肿瘤的治疗涉及非常复杂的光化学和光生物学反应，其机制至今尚不十分明确，但基本原理是肿瘤组织吸收光敏剂后，经特定波长的光照射，在生物组织中氧的参与下产生含氧自由基和/或单线态氧，ROS破坏肿瘤细胞［13］。本研究从上述各阶段探讨了光敏剂Photosan对人胰腺癌Panc－1细胞的作用机制。

2.1 PDT激发活性氧的产生 荧光显微镜和流式细胞术均检测到PDT后Panc－1细胞内产生了活性氧，这符合光动力反应的基本规律，并且从定性和定量两个方面均显示，随光敏剂浓度、光照剂量增加，活性氧的产生相应增多。这是由于提高光敏剂浓度增加了细胞内光化学反应的底物－光敏物质，而光照剂量的增强则使单位质量的底物吸收更多的能量，最终均通过能量传递使活性氧产生增多。这也必将导致最终对细胞表现出更强的杀伤效应。

2.2 PDT杀伤效应以诱导细胞凋亡为主 肿瘤细胞的破坏死亡分为凋亡和坏死，本研究结果显示PDT后24 h细胞凋亡和坏死两种形式都存在，并且与光敏剂浓度以及光照剂量呈正相关，但凋亡细胞的比例始终高于坏死比例，提示PDT对细胞的破坏以凋亡为主。

目前的研究认为，PDT可诱导肿瘤细胞凋亡，也可引起坏死，这取决于细胞的种类和PDT的剂量(包括光敏剂和光照剂量)。有学者［14］发现:当PDT剂量较小时，诱发细胞凋亡或坏死的刺激因素较弱，细胞凋亡起主要作用;而当刺激因素逐渐增强时，细胞逐渐过渡到以坏死为主。至今仍无一种统一的机制来解释这种现象。

本研究认为，引起上述分歧的原因之一可能在于对凋亡细胞检测时机的把握。根据本实验的经验，典型的凋亡特征往往出现在PDT后凋亡的早期或中期，此时细胞膜尚完整，不管是形态学还是荧光染色都容易确定凋亡的特征，若检测时间过迟，细胞的凋亡已发展至接近甚至已经死亡，则很难与坏死鉴别。当PDT剂量较大时，强大的光动力作用使细胞很快就发生一系列生化和病理改变而死亡，如果不注意把握时机及时检测，可能会造成细胞以坏死为主的假象。当然，这一问题仍待今后大量的研究予以进一步阐明。

2.3 Photosan诱导Panc－1细胞凋亡的机制初探PDT导致细胞发生凋亡的机制涉及不同的光敏剂在亚细胞内的定位、凋亡信号的触发及其在细胞内的各种传导途径等极其复杂的诸多环节。本研究为初步探讨Photosan对Panc－1细胞PDT后凋亡的现象及其可能机制，选择了caspase－3作为研究目标，结果显示随光敏剂浓度以及光照剂量的增加，细胞内caspase－3水平相应增加，表明细胞凋亡的发生。

Caspase家族在诱导细胞凋亡的分子机制中起着关键作用，是多条凋亡通路的汇聚点，是执行凋亡的最终途径。其中caspase－3被认为是凋亡的关键蛋白酶，一旦被激活，即发生下游的级联反应，发生凋亡［15－17］。

综上所述，我们认为被细胞吸收后分布于细胞膜或细胞器膜(如线粒体膜)等的光敏剂经PDT后产生各种活性氧成分，触发了凋亡的外途径和/或内途径，通过信号转导激活caspase－3，并且随光敏剂和光照剂量的增加，使该蛋白酶的激活更加显著。caspase－3的激活可以通过(1)酶解灭活凋亡抑制物，如Bcl－2等;(2)酶解细胞外基质及骨架蛋白，如角质蛋白等;(3)裂解DNA修复相关分子，如聚ADP核糖多聚酶等，最终使细胞的功能和形态发生变化而凋亡［18］。

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