eNOS基因标签单核苷酸多态性与新疆汉族原发性高血压的相关性研究*

邹放君， 唐 斌， 何 芳， 刘 成， 王 刚， 张 强，卢贤贵， 黄 刚， 石晓鹏， 杨建峰， 邓峰美

(1石河子大学医学院病理生理学教研室，新疆地方与民族高发病教育部重点实验室，新疆 石河子 832002;2石河子大学医学院第一附属医院，新疆 石河子 832008;3成都医学院病理学教研室，四川 成都 610083)

原发性高血压(essential hypertension，EH)是一种常见的严重影响人类健康的多基因遗传性疾病，发病是遗传和环境因素共同作用的结果。1991年我国的高血压普查，15岁及以上人口中高血压患病率为11.88%，新疆汉族高血压患病率为13.88%，高于我国平均发病率11.88%，而高血压的发病机制尤其新疆汉族高血压高发的遗传因素有待进一步阐明。内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)基因是近年来发现的EH的易感基因，由于其对血压调节的重要作用而备受重视。目前国内外已有研究发现eNOS基因多态性与高血压有密切关系［1－4］。eNOS基因目前已经发现了 10 多种SNP位点，一个染色体区域可以有很多SNP位点，但是只用少数几个具有代表性的标签SNP(tagging single nucleotide polymorphism，tSNP)就能够提供该区域内大多数的遗传多态模式，这样将大大减少用于基因型与疾病关联分析中的SNP，增加SNP分型有效性。关于eNOS基因标签多态性与新疆汉族原发性高血压的关系目前未见报道，本文采用tSNP(包括rs2070744、 rs1800779、 rs1799983、 rs3918188 和rs7830)方法，运用分子生物学手段，分析新疆汉族人群eNOS基因多态性，阐明连锁不平衡(linkage disequilibrium，LD)模式以及tSNP构成的单体型分布特征，揭示新疆汉族EH的分子遗传易感机制。

材料和方法

1 研究对象

样本来源于2006－2008年在新疆天山北麓塔城地区沙湾县博尔通古乡牧区的元兴宫村、红土庄子村及乌兰乌苏镇进行高血压病流行病学调查时采集的汉族人群样本，选择本地居住的汉族居民，无血缘关系，无异族通婚史，高血压患者346例，其中男148例，女198例，年龄18－68岁，对照组385例，男142例，女243例，年龄18－62岁。原发性高血压样本采集按照1999年10月WHO/ISH颁布诊断标准:收缩压≥140 mmHg或舒张压≥90 mmHg，排除继发性高血压、心肌病、心肌梗死、瓣膜性心脏病、先天性心脏病、过量饮酒、甲状腺疾病、肝肾功能不全、糖尿病、孕妇、哺乳期及口服避孕药妇女。对照组纳入标准:查体健康者，收缩压＜140 mmHg和舒张压＜90 mmHg，无服用降压药史、高血压家族史及其它器质性心脏病史等。

2 调查内容

采用统一的调查表以1对1的形式进行调查研究，测量身高、体重、腰围、臀围，计算体重指数［body mass index，BMI=体重(kg)/身高2(m2)］和腰臀比［waist to hip ratio，WHR=腰围(cm)/臀围(cm)］，询问职业、文化程度、婚姻状况、吸烟、饮酒、饮食习惯、性格特点、疾病及家族史等，抽血临床检测血糖、血脂(甘油三酯、胆固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白)等生化指标。

3 基因组DNA提取

实验前夜禁食12 h以上。次晨抽取空腹血液标本10 mL，用肝素和EDTA抗凝管，分离血样，血浆当天做生化检测。血液用酚－氯仿法进行DNA抽提。

4 eNOS基因目的片段扩增

设计PCR引物用于扩增包含SNP位点的片段，紧邻SNP位点的延伸引物用于单碱基延伸。检索美国国立生物技术信息中心公共数据库中SNP位点序列，用Primer Premier 5.0软件设计PCR引物及延伸引物，分别见表1、表2。PCR反应体系:DNA模板1 μL，HotStar Taq 聚合酶 0.2 μL，10 × buffer 2 μL，25mmol/L MgCl21.2 μL，dNTP 0.6 μL，多重 PCR 引物 2 μL，去离子水 13 μL，总体系 20 μL。利用 ABI公司的2720 Thermal Cycler预变性94℃ 5 min，94℃ 30 s，59 ℃ 40 s，72 ℃ 45 s，35 个循环，最后72 ℃10 min。

表1 PCR引物序列与扩增参数Table 1.PCR primer sequences and amplification parameters

5 eNOS基因片段多态性检测

利用SNaPshot SNP分型技术进行SNP位点分型。PCR产物延伸反应即单碱基延伸反应。延伸反应体系(10 μL)包括2 μL纯化后PCR产物，5 μLSNaPshot Multiplex Kit(ABI)，1 μL 延伸引物，2 μL超纯水。PCR循环程序:96℃预变性1 min;28×(96℃ 10 s，50℃ 5 s，60℃ 30 s);60℃ 充分延伸1 min;4℃保存。延伸产物纯化，在10 μL延伸产物中加入1 U Taq酶，37℃温浴1 h，然后75℃灭活15 min。取 0.5 μL 纯化后的延伸产物，与 0.5 μL LIZ120 Size Standard，9 μL Hi－Di混匀，95 ℃变性5 min后上ABI 3130XL测序仪，收集的原始数据用GeneMapper 4.0(Applied Biosystems)来分析，进行基因型判断。

表2 单碱基延伸引物序列Table 2.Single－base extension primer sequences

6 tSNP选择

依据HapMap的数据库及位点间的LD程度(D'＞0.8，r2＞0.8为标准)，以10%频率为界，并考虑SNP的功能，选择的tSNP为5个，分别为:位于启动区的rs2070744，第7外显子的rs1799983，第1内含子的rs1800779，第5内含子的rs3918188，第12内含子的rs7830。

7 统计学处理

采用SPSS 13.0统计学软件对数据进行统计分析。病例组与对照组计量资料比较用t检验，计量资料用均数±标准差()表示。进行Hardy－Weinberg平衡检验确认研究样本的群体代表性，计数资料比较用卡方检验，病例组与对照组基因型与等位基因分布频率差异比较用卡方检验，P＜0.05有统计学差异。连锁不平衡及单体型分析分别采用Data Analyser 0.34和Phase 2.1软件。D'(连锁不平衡系数)＜0.2被认为不具有连锁不平衡，D'＞0.5具有连锁不平衡，D'＞0.8具有强连锁不平衡，D'=1处于完全连锁不平衡;r2代表相关系数。Logistic回归分析各危险因素与高血压的关系。

结 果

1 研究对象一般情况

各指标如收缩压、舒张压、平均动脉压、脉压、体重指数、腰臀比、胆固醇、低密度脂蛋白、肌酐、尿酸、载脂蛋白A1/B的平均水平，两组间比较均有显著差异(P＜0.05)，EH组均高于对照组;其余指标如年龄、性别、空腹血糖、甘油三酯、高密度脂蛋白、载脂蛋白－A1、载脂蛋白 －B两组间均无差异(P＞0.05)，见表3。

表3 新疆汉族EH组与正常对照组临床相关指标比较Table 3.Comparison of clinical characteristics between essential hypertension(EH)and healthy subjects in the Han population of Xinjiang

2 eNOS基因位点基因型及等位基因在新疆汉族EH组与对照组中的分布及患病风险估计

eNOS基因tSNP位点基因型分布均符合Hardy－Weinberg平衡(P＞0.05)，提示该人群有较好的代表性。表4中eNOS基因rs3918188位点等位基因C、A在 EH组和对照组中分布频率分别为 485(70.1%)、207(29.9%)和 497(64.5%)、273(35.5%)，EH组C等位基因频率高于对照组，C等位基因患病风险为A等位基因1.287倍(95%CI 1.033－1.603，P＜0.05)，EH组和正常对照组等位基因分布频率有显著差异(P＜0.05)。rs7830位点基因型CC、AC、AA在EH组及正常对照组中的分布频率 分 别 为 126(36.4%)、185(53.5%)、35(10.1%)和 145(37.7%)、173(44.9%)、67(17.4%)，EH组和正常对照组基因型频率分布有显著差异(P＜0.01)。其它tSNP位点基因型及等位基因频率分布在EH组和对照组间无显著差异(P＞0.05)，见表 4。

表4 新疆汉族高血压组与对照组间tSNP位点基因型分布及等位基因频率比较Table 4.Comparison of genotypic distributions and allele frequencies of tSNPs of eNOS gene between healthy and essential hypertension(EH)subjects in the Han population of Xinjiang

3 新疆汉族人群eNOS基因tSNP位点间连锁不平衡分析

我们对5个多态位点分别进行了配对连锁不平衡分析，采用Data Analyser软件分析，当D'＞0.8且r2＞0.3时认为两位点间存在强的连锁不平衡，本研究结果发现除rs1800779和rs2070744位点间存在强连锁不平衡外，其它位点间不存在强连锁不平衡。其D'和r2值分别见表5、图1。

表5 新疆汉族人群eNOS基因多态位点间的连锁不平衡分析Table 5.Linkage disequilibrium analyses of tSNP of eNOS gene in the Han population of Xinjiang

Figure 1.Linkage disequilibrium structure chart of tSNP of eNOS gene.图1 eNOS基因tSNP位点间连锁不平衡结构图

4 新疆汉族人群eNOS基因tSNP单体型分析及患病风险估计

用Phase 2.1软件构建的新疆汉族总人群单体型如表6所示，eNOS基因 rs2070744、rs1800779、rs1799983、rs3918188和 rs7830构成 12种单体型(TAGAC、TAGCA、TAGCC、CGGCA、TATCC、TAGAA、TATCA、CGGCC、CGTCC、CGGAC、TATAC 和CATCC)。单体型在新疆汉族EH组和对照组分布如表7所示，单体型TAGAC频率在EH组低于对照组，差异显著(P＜0.05)，单体型TAGCC频率在EH组高于对照组(P＜0.05)。而 TAGCA、CGGCA、TAGAA和CGTCC的频率在EH组低于对照组，但无显著差异，TATCC的频率在EH组高于对照组，也无显著差异(P＞0.05)。

表6 新疆汉族eNOS基因单体型分布Table 6.Distribution of haplotypes of eNOS gene in the Han population of Xinjiang

表7 eNOS基因单体型在新疆汉族高血压组和对照组中的分布Table 7.Distribution of haplotypes of eNOS gene between healthy and essential hypertension(EH)subjects in the Han population of Xinjiang

5 Logistic回归分析

以有无高血压为因变量，体重指数、腰臀比、年龄、空腹血糖、胆固醇、甘油三酯等为自变量进行多因素Logistic回归分析，结果显示体重指数增大、年龄、高血糖、高脂血症为高血压发生的独立危险因素，见表8。

表8 新疆汉族高血压与其影响因素的Logistic回归分析Table 8.Logistic regression analysis between influential factor and essential hypertension in the Han population of Xinjiang

讨 论

高血压是严重危害人类健康的一种常见病、多发病，发病原因尚未完全清楚，它的发病机制非常复杂。原发性高血压具有遗传倾向，它是一种多基因遗传性疾病，其基因表达在很大程度上受环境因素的影响。许多研究显示人群超重和肥胖与血压升高有关［5－8］，超重和肥胖是高血压的危险因素。久居新疆的汉族居民由于环境条件、生活方式及饮食习惯与内地汉族存在地域差异。本研究选择长期居住在新疆的汉族居民，均生活在边远的牧区和农村，而且冬季时间较长，居民喜食肉食，户外运动较少，与内地汉族生活环境和方式不同。本研究高血压组与对照组一般资料比较显示新疆汉族高血压人群中体质指数、腰臀比、胆固醇及低密度脂蛋白明显高于正常对照人群，提示超重、肥胖及血脂异常(包括血浆胆固醇、低密度脂蛋白浓度增高)可能为该地区汉族高血压的危险因素。进一步作Logistic回归分析校正了年龄、性别、BMI及临床指标等混杂因素后，结果显示体重指数增大、年龄、高血糖、血脂异常为该地区汉族高血压的独立危险因素，从而证实了血脂异常、超重和肥胖与该地区汉族高血压的发生有关。

本研究中eNOS基因rs2070744位点T、C等位基因与rs1799983位点G、T等位基因频率在新疆汉族健康对照人群分布分别为89.1%、10.9%和90.1%、9.9%，而内地北方汉族分别为 90.7%、9.3%和89.1、10.9%［9］，两者多态性分布无显著差异。美国白种人分别为58.0%、42.0%和65.5%、34.5%，美国黑种人为82.5%、17.5%与84.5%、15.5%［10］，巴西白种人为58.1%、41.9%和67.2%、32.8%，黑种人为80.5%、19.5%和84.9%、15.1%［11］，巴西印第安人为 96.8%、3.2% 和 95.0%、5.0%［12］，均与本研究结果eNOS基因rs2070744和rs1799983位点等位基因频率分布存在差异。

新疆其他民族未见rs2070744位点相关报道，新疆维吾尔族人rs1799983位点G、T等位基因频率分别为77.2%、22.8%［13］，与本研究结果等位基因频率分布也存在差异。在上述结果可以看出上述位点在不同种族人群存在较大的差别。其它位点rs1800779、rs3918188、rs7830等位基因频率在新疆汉族健康对照人群分布分别为:A:89.1%，G:10.9%，C:64.5%，A:35.5%，C:60.1%，A:39.9%。而在国内外其他民族少见报道。eNOS基因rs3918188位点等位基因C、A在EH组和对照组中分布频率分别为485(70.1%)、207(29.9%)和497(64.5%)、273(35.5%)，EH组C等位基因频率高于对照组(P＜0.05)，C等位基因患病风险为A等位基因1.287倍(95%CI 1.033－1.603，P＜0.05)。rs7830位点基因型CC、AC、AA在EH组及正常对照组中的分布频率分别为 126(36.4%)、185(53.5%)、35(10.1%)和 145(37.7%)、173(44.9%)、67(17.4%)，EH组和正常对照组基因型频率分布有显著差异(P＜0.01)。该研究结果表明rs3918188C等位基因可能是新疆汉族EH的易感因素，rs7830位点多态性与新疆汉族高血压相关。

新疆汉族高血压组和健康对照组eNOS基因rs2070744、rs1799983、rs 1800779 位点基因型与等位基因分布频率无差异(表4)，可能与以下因素有关:(1)基因突变存在着种族、地理和环境因素的差异，在上述研究结果中可以看出不同种族和不同地域多态分布特征不同，从而影响到与疾病的关联;(2)疾病本身的复杂性，不是单个位点突变可以解释的。高血压病是多个基因和环境因素间相互作用导致的复杂病理过程，单个位点突变并不能决定疾病的发生，而是和其它位点突变以及年龄、吸烟和高血脂等危险因素共同导致疾病的发生;(3)研究中样本量不够大以及基因之间的连锁不平衡现象。

连锁不平衡是指在某一群体中，某2个等位基因出现在同一条单体型不同SNP位点上的频率与其预期的随机频率之间存在明显差异的现象。连锁不平衡在关联性分析中起到了重要作用，这是因为我们可以通过致病基因周围的位点检测到与疾病的相关性。我们在新疆汉族人群中做了5个位点的连锁不平衡分析，结果发现除rs1800779和rs2070744位点间存在强连锁不平衡外，其它位点间不存在强连锁不平衡。单体型是指一条染色体上紧密相连的2个或2个以上基因座的一组等位基因组成的基因型。单个SNP进行遗传分析的效力较小，由几个连锁位点组成的单体型则能提供更多更可靠的信息。以单体型为基础进行关联分析，比利用单个SNP位点对每个基因的检测更为有效，可以增加灵敏性和全面性，更能全面地评价候选基因在疾病发生发展中的作用。本研究采用Phase 2.1软件对新疆汉族人群eNOS基因tSNP构成的单体型进行了分析，发现在新疆汉族人群中tSNP构成12种单体型，最常见的单体型为TAGAC(30.23%)、TAGCA(26.13%)和TAGCC(21.41%)。EH组和对照组分别构成11种单体型，其中单体型的TAGAC频率在EH组低于对照组(P＜0.05)，单体型的TAGCC频率在EH组高于对照组(P＜0.01)。而单体型TAGCA、CGGCA、TAGAA、CGTCC频率在高血压组低于对照组，TATCC频率在高血压组高于对照组，均无显著差异。因此，eNOS基因tSNP构成的单体型可能与新疆汉族原发性高血压相关。

综上所述，本研究对象选择来自一个遗传和环境上相对均质的群体，结果表明在新疆汉族人群中eNOS基因rs3918188C等位基因携带者患高血压的风险明显增高，rs7830位点多态性与新疆汉族高血压相关，而其它tSNP可能与该民族EH不相关。除rs1800779和rs2070744位点间存在强连锁不平衡外，其它tSNP位点间不存在强连锁不平衡，tSNP构成的单体型可能与新疆汉族EH相关。由于本研究样本量有限，还需进一步扩大样本量证实本研究结果。

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