四川和河南烤烟叶片番茄红素β环化酶基因的表达分析

贾 峰，魏庆华，刘卫群,2

(1.河南农业大学，国家烟草栽培生理生化重点实验室，郑州 450002；2.河南农业大学生命科学学院，郑州 450002)

类胡萝卜素（Carotenoids）是广泛存在于自然界一类重要天然色素的总称，主要由直链番茄红素在一端或两端环化后形成[1-2]。植物中起环化作用的酶主要有番茄红素β环化酶（lycopene cyclase，Lycβ）和番茄红素ε环化酶（Lyc-ε）2种。Lyc-β酶的主要功能是催化番茄红素直链的一端或两端，形成β环化，从而形成β玉米胡萝卜素、γ胡萝卜素和无所不在的β胡萝卜素；Lyc-β和Lyc-ε酶共同催化形成常见的α胡萝卜素；而Lyc-ε酶虽然可以单独催化形成ε胡萝卜素，但在植物体内鲜见[3-4]。因此，Lyc-β酶是生产类胡萝卜素的关键酶（基因）。

类胡萝卜素是烤烟烟叶主要致香成分的前体物[5-9]，与烤后烟叶中性致香成分含量呈显著正相关关系[10]。最近的研究表明，不同生态区烟草中类胡萝卜素含量差异很大[11]。将不同生态区烤烟烟叶中类胡萝卜素积累与Lyc-β基因转录水平直接联系的报道很少。为此，笔者采用半定量RT-PCR并结合Northern杂交的方法研究了四川会理（清甜香型烟叶）与河南宝丰（浓香型烟叶）2个不同生态区现蕾期烟叶中Lyc-β基因表达的差异，旨在从分子水平揭示其含量差异的原因，为深入分析不同生态区烟叶类胡萝卜素的降解产物含量差异提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

取烤烟（Nicotiana tabacumL.）品种云烟85现蕾期上部烟叶为试验材料，分别于 2008—2009年在四川会理和河南宝丰进行大田试验。

1.2 RNA提取、RT-PCR扩增和Northern杂交

烟叶总RNA 的提取和cDNA第一链的合成以及半定量 RT-PCR体系参照文献[12]的方法进行。烟草Lyc-β(GenBank 登录号为 X81787.1)正向引物序列为：5' CAA GAA AGA ATG GTG GCT 3'，反向引物序列为：5' CAG GCG AGA TGA CAA GAA 3'（扩增片段长度为432 bp）；肌动蛋白基因（Actin）(GenBank登录号为 EU938079)的引物设计和扩增参考文献[12]的方法进行。以肌动蛋白基因的相对含量作为内参，按Actin扩增后灰度分析的结果添加模板量。用UVBand紫外-可见分光光度计计算机软件对电泳条带进行灰度分析，以调整Lyc-β基因PCR 扩增时的模板量。PCR扩增条件同上，取等体积的PCR 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。溴化乙锭（EB）染色后，采用 UVBand紫外-可见分光光度计计算机软件对基因相对表达量进行分析。Northern杂交按照文献[13]的方法进行，探针是DIG DNA Labeling Kit（Roche）标记的Lyc-β基因RT-PCR产物。

1.3 类胡萝卜素检测及数据处理

根据GB/T 5009.83—2003标准，分别取四川和河南烤烟上部烟叶的杀青烘干样品，送云南省烟草农业科学研究院分析测试中心检测类胡萝卜素含量，4次重复。试验数据采用Student’st检验（P≤0.05和P≤0.01）分析。

2 结 果

2.1 RNA电泳

用1%琼脂糖凝胶电泳检测烟叶总RNA的结果(图1)表明，28 S、18 S、5 S三条带中28 S和18 S带比较亮，说明RNA样品并未发生降解；A260/A280在1.90～2.00之间，说明RNA样品的纯度高，可用于cDNA的合成。

图1 烟叶总RNA的电泳检测Fig.1 Total RNA separated on agarose gel

2.2 Lyc-β引物和内参Actin引物RT-PCR结果

从图2可以看出，Lyc-β基因PCR扩增产物的条带比较清晰，基本上没有拖尾现象。两地区烟叶的Actin扩增产物基本一致，而四川烟叶中Lyc-β基因扩增的条带亮度大于河南的，说明在现蕾期四川烟叶中Lyc-β基因表达水平高于河南的。

图2 Lyc-β基因的半定量RT-PCR结果Fig.2 Semi-quantitative RT-PCR analysis of Lyc-β

2.3 Lyc-β基因表达的Northern杂交结果

Northern杂交结果(图3)显示，在两个泳道RNA量一致的情况下，烟叶的杂交带四川比河南的亮，表明四川烟叶中Lyc-β基因表达水平高于河南的。

图3 Lyc-β表达的Northern杂交分析Fig.3 Northern blotting analysis of the Lyc-β expression

2.4 上部烟叶类胡萝卜素含量变化

通过检测分析发现，现蕾期烤烟上部叶中叶黄素含量四川为（311.7±15.81）μg/g（DW），河南烟叶中的为（264.15±14.00）μg/g（DW）；四川和河南烤烟中β胡萝卜素的含量分别为（104.93±4.62） μg/g（DW）和（69.53±3.40）μg/g（DW）；Student’st检验结果表明，叶黄素和β-胡萝卜素含量四川烟叶极显著地（P≤0.01）高于河南的。这与基因Lyc-β的半定量RT-PCR和Northern杂交的结果相符。

3 讨 论

烟草番茄红素β环化酶的基因序列是 1996年由 Cunningham 等[7]首次克隆和鉴定出来的，随后在番木瓜和马铃薯中鉴定出有2种Lyc-β基因，一种在光合组织中表达，而另一种在花和果实中特异表达[14-15]。本研究据Cunningham等在GenBank中发表的烟草中类胡萝卜素合成的关键酶Lyc-β基因的序列设计引物，用半定量RT-PCR和Northern杂交技术分析了四川和河南烤烟现蕾期Lyc-β基因的表达量，结果表明，四川烟叶现蕾期Lyc-β基因表达水平明显高于河南（图2和图3）；四川同期的杀青样品检测表明类胡萝卜素（包括叶黄素和β-胡萝卜素）含量也明显高于河南（图4）。这表明烟叶类胡萝卜素含量和番茄红素β环化酶基因表达量的变化趋势是一致的。由此Lyc-β基因可以作为类胡萝卜素含量预测的分子指标，通过测定烤烟生长期Lyc-β基因的转录水平来预测烟叶成熟期类胡萝卜素含量。

2000年，Ye等[16]把Lyc-β基因导入水稻，能够使本来不含类胡萝卜素的水稻胚乳中合成了4种类胡萝卜素。而Dharmapuri等[17]在2002年通过基因工程手段把Lyc-β基因转入番茄，使番茄果实中的类胡萝卜素增加近 10倍，表明Lyc-β基因的表达升高可以显著提高类胡萝卜素的生物合成。因此，可以通过基因工程的手段来提高烟叶中类胡萝卜素的含量，并且丰富烟草种质资源。

一般认为类胡萝卜素的合成与温度、光照和湿度等有关，这些环境因子对植物体内类胡萝卜素合成基因的表达有明显影响[18]，然而环境因子包括了温度、光照、湿度、空气、土壤等因子，其中是什么因子对Lyc-β基因的表达影响较大？是通过何种途径影响的？需要进一步深入研究，才能够更加准确地实现通过对环境因子的调控，达到调控类胡萝卜素合成的过程。

4 小 结

通过RT-PCR扩增和Northern杂交检测发现四川和河南烟叶中Lyc-β基因表达量的结果基本一致，在现蕾期四川烟叶中Lyc-β基因表达水平明显高于河南烟叶的。在现蕾期四川烤烟上部叶中叶黄素的含量显著高于河南的。这与基因Lyc-β的半定量RT-PCR和Northern杂交的结果相互统一。因此，四川和河南两个生态区烟叶中类胡萝卜素含量的差异可能与Lyc-β基因的表达差异有关，为进一步深入揭示不同生态对烤烟香气风格的形成具有一定的理论意义。

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