通淋片薄层鉴别与定量测定研究

李晓燕，李正杰，许红辉，赵韶华

(河北以岭医药研究院，河北 石家庄 050035)

通淋片为我公司研发的中药6类新药，由黄芩、柴胡、大黄、苦参、乌药、川牛膝等10味中药组方，具有疏解肝经气滞、清化下焦湿热的功能，主要用于治疗急性下尿路感染，疗效显著。为有效控制产品质量，对方中柴胡、大黄、苦参、乌药进行了薄层色谱(TLC)研究，采用高效液相色谱(HPLC)法对黄芩中黄芩苷进行定量研究，建立了通淋片的质量控制方法，现报道如下。

1 仪器与试药

Waters 515型Pump高效液相色谱仪;Waters 2487 Dual λAbsorbemce Detector;AT201型Mettler－toledo电子天平;KQ－250B型超声波清洗器。通淋片(石家庄以岭药业股份有限公司，批号为20061101);黄芩苷对照品(批号为为715200211)，苦参碱对照品(批号为110805200306)，柴胡对照药材(批号为1209920301)，大黄对照药材(批号为120902200408)，乌药对照药材(批号为121096200402)，均购自中国药品生物制品检定所;甲醇(色谱纯)，水为纯化水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 定性鉴别

2.1.1 柴胡

取本品5片，研细，加甲醇20 mL，超声处理15 min，滤过，滤液蒸干，残渣用水15 mL溶解，用水饱和正丁醇振摇提取2次，每次20 mL，合并正丁醇层，用3%氢氧化钠溶液20 mL洗涤1次，弃去氢氧化钠溶液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。另取柴胡对照药材0.5 g，加甲醇7 mL，超声处理15 min，滤过，滤液作为对照药材溶液。另按处方比例和制法制成不含柴胡的阴性样品，同供试品溶液的制备方法制成阴性对照品溶液。照薄层色谱法[1]试验，吸取上述3种溶液各5 μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以氯仿－甲醇－水(6∶2∶0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%对二甲氨基苯甲醛10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的主斑点，阴性对照品溶液无干扰(见图1 A)。

2.1.2 苦参

取本品3片，研细，加甲醇7 mL，超声处理15 min，滤过，取续滤液，作为供试品溶液;另取苦参碱对照品，加甲醇制成每1 mL含0.6 mg的溶液，作为对照品溶液。另按处方比例和制法制成不含苦参的阴性样品，同供试品溶液的制备方法制成阴性对照品溶液。照薄层色谱法[1]试验，吸取供试品溶液及阴性对照品溶液各5 μL、对照品溶液4 μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯－乙醇－浓氨(10∶1∶0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照品溶液无干扰(见图1 B)。

图1 柴胡和苦参的薄层色谱图

2.1.3 大黄、乌药

取大黄对照药材0.2 g、乌药对照药材0.5 g，分别加甲醇5 mL，超声处理15 min，滤过，取续滤液作为大黄或乌药对照药材溶液。另按处方比例和制法分别制成不含大黄的阴性样品和不含乌药的阴性样品，分别同2.1.2项下供试品溶液制备方法制成大黄或乌药的阴性对照品溶液。照薄层色谱法[1]试验，吸取2.1.2项下的供试品溶液与上述对照药材溶液、阴性供试品溶液各5 μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以环乙烷－乙酸乙酯 －甲酸(6∶2∶0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯(365 nm)下检视。供试品溶液色谱中，在与大黄对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的主斑点，阴性对照品溶液无干扰(见图2 A)。再喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，置紫外灯(365 nm)下检视。供试品溶液色谱中，在与乌药对照药材溶液色谱相应位置上至少显2个相同颜色的斑点，阴性对照品溶液无干扰(见图 2 B)。

图2 大黄和乌药的薄层色谱图

2.2 定量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱:Waters Symmetry C18柱 (150 mm ×4.6 mm，5μm);流动相:甲醇－0.1%磷酸(47∶53);流速:1 mL/min;检测波长:280 nm;理论板数按黄芩苷峰计算应不低于2500。

2.2.2 溶液制备

取黄芩苷对照品适量，精密称定，加70%甲醇制成每1 mL含10 μg的溶液，即得对照品溶液。取本品10片，除去薄膜衣，精密称定，研细，取0.3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加70%甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声处理(功率250 w，频率40 kHz)20 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液1 mL，置25 mL量瓶中，加70%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。另取方中除黄芩之外的其他药材，按照制备工艺制得阴性样品，采用供试品溶液的处理方法进行处理，制成阴性对照品溶液。

2.2.3 方法学考察

阴性干扰试验:精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照品溶液各20 μL，注入高效液相色谱仪，测定。结果阴性对照不干扰黄芩苷的测定，高效液相色谱图见图3。

图3 高效液相色谱图

标准曲线绘制:分别精密吸取对照品溶液(0.2228g/L)1，2，3 mL，置10 mL量瓶中，加70%甲醇至刻度，摇匀，再分别精密吸取(0.02228g/L)的对照品溶液各1 mL，分别置2 mL及5 mL的容量瓶中，加70%甲醇至刻度，摇匀，精密吸取上述对照品溶液各20 μL注入液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积积分值为纵坐标(Y)、黄芩苷进样量(ng)为横坐标(X)绘制标准曲线，得回归方程Y=74232.021+3777.5469 X，r=0.99991。结果表明，黄芩苷进样量在89.12～1336.80 ng范围内与峰面积积分值具良好的线性关系。

精密度试验:精密吸取对照品溶液及供试品溶液各20 μL，在上述色谱条件下连续进样5次，测定峰面积。结果对照品溶液的RSD为0.45%，供试品溶液的 RSD为0.68%(n=5)。

稳定性试验:精密吸取对照品溶液及供试品溶液各20 μL，分别于0，2，6，12，15 h时进样，测定峰面积。结果对照品溶液的 RSD为0.80%，供试品溶液 RSD为2.33%(n=5)，表明黄芩苷在15 h内检测，峰面积稳定。

重复性试验:取同一批样品 9 份，分别取高(0.36 g)、中(0.30 g)、低(0.24 g)3个剂量，按供试品溶液的制备方法进行制备、测定。结果样品中黄芩苷的平均含量为22.53 mg/g，RSD为2.38%，表明方法重复性良好。

加样回收试验:取同一批样品9份，分为3组，分别精密加入25 mL不同质量浓度的黄芩苷对照品的70%甲醇溶液，超声提取，测定，计算回收率。结果见表1。

表1 黄芩苷加样回收试验结果(n=9)

2.2.4 样品含量测定

用所拟订的含量测定方法，对3批通淋片进行了黄芩苷含量测定，结果3批样品的平均含量为18.89 mg/g。

3 讨论

苦参碱鉴别一般选择苯或氯仿作展开剂，本研究首次发现，用乙酸乙酯－乙醇－浓氨(10∶1∶0.5)作展开剂，斑点清晰、圆整、分离较好，毒性降低，利于环保。大黄的主要成分为蒽类衍生物，乌药的主要成分为呋喃倍半萜及其内酯等，二者成分不同，但本研究采用相同的供试品制备方法、相同的展开剂进行展开，采用不显色检测大黄斑点、显色后检测乌药斑点的处理方法来鉴别大黄和乌药，方法简便、快捷。

黄芩苷含量测定时，样品处理方法简单，色谱峰分离度好，精密度高。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:化学工业出版社，2005:附录31－附录32.