心脑联通片质量标准研究

宋冬梅 ，黎鄂恒，吴 宁，李堂秀 ，顾承刚

(1.湖北省荆门市第一人民医院药剂科，湖北 荆门 448000; 2.湖北省中医院药事部，湖北 武汉 430061;3.武汉药谷科技开发有限公司，湖北 武汉 430070)

心脑联通片由灯盏细辛、虎杖、野山楂、柿叶、刺五加、葛根、丹参组方，由心脑联通胶囊[1]改变制剂成型工艺而成，具有活血化瘀、通络止痛的功效，用于瘀血闭阻引起的胸痹、眩晕，症见胸闷、胸痛、心悸、头晕、头痛、耳鸣等，以及冠心病心绞痛、脑动脉硬化、高脂血症见上述证候者。笔者保持原胶囊剂型的提取工艺，仅改变成型工艺，将其制成心脑联通片，并研究了其质量标准，现报道如下。

1 仪器与试药

P3000型高效液相色谱仪(北京创新通恒科技有限公司)，包括3000 UV紫外检测器;CQ250型超声波仪(上海超声波仪器厂)。硅胶G(青岛海洋化工厂);羧甲基纤维素钠(国药集团化学试剂有限公司)。心脑联通片(武汉药谷科技开发有限公司制剂室提供，批号为20080301，20080302，20080303，20080304，20080305，20080306);大黄素对照品(批号为110756－200110)、野黄芩苷对照品(批号为110842－200403)、葛根素对照品(批号为 110752－200310)，丹参酮ⅡA对照品(批号为110766－200403)，均由中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用;甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 灯盏细辛

取本品10片，除去包衣，研细，称取 2 g，加热水25 mL，研磨5 mim，离心，取上清液，用乙酸乙酯萃取3次，每次20 mL，弃去乙酸乙酯液，水层用稀盐酸调节pH至2～3，用乙酸乙酯萃取2次，每次20 mL，水层备用，合并乙酸乙酯液，水浴蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。取不含灯盏细辛的自制阴性样品10片，同供试品溶液的制备方法制备，即得阴性对照品溶液。取野黄芩苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL含1 mg的对照品溶液。照薄层色谱法，吸取上述3种溶液各2 μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以冰醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%三氯化铁乙醇溶液。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照品溶液色谱中则无此斑点(见图1 A)。

2.1.2 葛根[2]

取2.1.1项下水液，水浴蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，加中性氧化铝7 g，拌匀，挥干，加入50%甲醇50 mL振摇提取，过滤，滤液水浴蒸干，残渣加乙醇1 mL溶解，过滤，作为供试品溶液。取不含葛根的自制样品10片，同供试品溶液的制备方法制备，即得阴性对照品溶液。取葛根素对照品适量，加甲醇制成每1 mL含1 mg的对照品溶液。照薄层色谱法，吸取对照品溶液5 μL、供试品溶液和阴性对照品溶液各10 μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以氯仿－甲醇－水(7∶2.5∶0.25)为展开剂，展开，取出，晾干，置饱和氨蒸气中放置10 mim，取出，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的荧光斑点，阴性对照品溶液色谱中则无此斑点(见图1 B)。

2.1.3 丹参

取本品10片，除去包衣，研细，称取3 g，加甲醇30 mL超声处理30 mim，滤过，滤液蒸干，残渣加水30 mL，加热使溶解，放冷，用乙醚提取2次，每次20 mL，合并乙醚液，低温挥干，残渣加甲醇0.5 mL使溶解，作为供试品溶液。取不含丹参的自制阴性样品10片，同供试品溶液的制备方法制备，即得阴性对照品溶液。取丹参酮ⅡA对照品适量，加甲醇制成每1 mL含1 mg的对照品溶液。照薄层色谱法，吸取上述3种溶液各10 μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以石油醚(30～60℃)－乙酸乙酯(12∶1)为展开剂，展开2次，取出，晾干。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照品溶液色谱中则无此斑点(见图1 C)。

2.2 大黄素含量测定

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:Hypersil C18柱(250 mm ×4.6 mm，5μm);流动相:甲醇－0.1%磷酸(80∶20);检测波长:254 nm;柱温:25℃;流速:1 mL/min;进样量 10 μL;检测灵敏度:1.0000 AUFS。理论板数按大黄素峰计算应不低于4000。色谱图见图2。

图1 薄层色谱图

图2 高效液相色谱图

2.2.2 溶液制备

精密称取经五氧化二磷减压干燥24 h的大黄素对照品适量，加甲醇制成每1 mL含30 μg的溶液，即得对照品溶液。取本品5片，除去包衣，研细，称取约0.3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入三氯甲烷25 mL和2.5 mol/L的硫酸溶液20 mL，密塞，称定质量，置80℃水浴中加热回流2 h，冷却至室温，密塞，再称定质量，用三氯甲烷补足减失的质量，摇匀，分取三氯甲烷液，精密量取10 mL，蒸干，残渣加甲醇使溶解，转移至10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液，取不含虎杖的自制阴性样品，同供试品溶液制备方法，制备阴性对照品溶液。

2.2.3 方法学考察

线性关系考察:精密称取大黄素对照品0.0093 g，置100 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取3 mL，置50，25，10，5 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成质量浓度分别为5.58，11.16，27.9，55.8 μg/mL 的对照品溶液，分别吸取各对照品溶液10 μL，注入色谱仪测定，以大黄素的进样量为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程 Y=4016662 X+37897，r=0.9999(n=5)。结果表明，大黄素进样量在 0.0558 ～ 0.9300 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

精密度试验:精密吸取同一对照品溶液，按拟订的色谱条件，重复进样6次，测定峰面积。结果的 RSD=0.69%(n=6)，表明仪器精密度良好。

稳定性试验:分别精密吸取同一供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，10 h时进样，测定峰面积。结果的 RSD为 0.42%(n=6)，表明供试品溶液在10 h内保持稳定，能保证测定的时间要求。

重复性试验:取同一批样品6份，按供试品溶液制备方法平行处理并测定，计算含量。结果含量平均值为2.864 mg/g，RSD=1.22%(n=6)，表明方法重现性良好。

加样回收试验:取已知含量的样品(批号为20080301，含量为2.864 mg/g)6份，分别精密加入质量浓度为0.4 g/L的大黄素对照品溶液1 mL，依法测定含量，计算回收率。结果见表1。

表1 大黄素加样回收试验结果(n=6)

2.2.4 样品含量测定

取供试品溶液和对照品溶液各10 μL，注入色谱仪，记录峰面积，按外标法计算大黄素的含量，每批样品测定3份。结果见表2。

表2 样品含量测定结果(mg/片)

3 讨论

关于葛根的薄层色谱鉴别，原质量标准中样品处理方法复杂、损失较大。通过试验发现，葛根素水溶性极强，用乙酸乙酯萃取后仍保留在水层，故将提取野黄芩苷后的水层用氧化铝吸附除杂，50%甲醇振摇提取，即可用将葛根素较好地分离出来。原质量标准中使用五元展开剂，配制麻烦，故参照2005年版《中国药典(一部)》葛根药材鉴别项下的展开剂，以三氯甲烷－甲醇－水(7∶2.5∶0.25)为展开剂，效果良好。改进后的鉴别方法操作更简便、灵敏度更高，提高了可操作性和检验的准确性。

关于丹参的薄层色谱鉴别，原质量标准中使用石油醚(60～90℃)作为萃取溶剂，通过试验发现，虽然提取的杂质较少，但丹参酮ⅡA提取效率低，需要较大的点样量方可检出。改用乙醚萃取后，萃取效率提高，正常点样即可检出，且杂质对其无干扰。原质量标准中展开剂为甲苯－乙酸乙酯(18∶1)，由于甲苯毒性较大，改用石油醚(30～60℃)－乙酸乙酯(12∶1)，展开2次，展开效果良好。改进后的鉴别方法提高了检测的灵敏度，减少了毒性试剂对环境的污染，更加科学环保。

关于虎杖所含大黄素的含量测定，原质量标准中分取氯仿层时较易损失，操作引起的误差较大。将其改为分取氯仿层后精密量取部分氯仿层，通过体积换算得出原液的含量，减小了操作误差;并将流动相由甲醇－0.2%磷酸(75∶25)调整为甲醇－0.1%磷酸(80∶20)，增大了甲醇比例，缩短了保留时间，柱温25℃即可获得较好的分离效果，同时降低了酸浓度，减小了流动相对色谱系统的损害，且柱效较高，故选用甲醇－0.1%磷酸(80∶20)作为流动相。改进后的含量测定方法更加简便、高效。

文中建立的定性定量方法简便、快速、重现性好，能有效地控制心脑联通片的质量。

[1]WS－10031－(ZD－0031)－2002，中华人民共和国国家药品监督管理局标准·地标升国标(心系分册)[S].

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:化学工业出版社，2005:233，52.