西罗莫司胶囊微生物限度检查方法的建立

郑小玲，李 珏，张联珍，王知坚

(1.浙江省食品药品检验所，浙江 杭州 310004; 2.浙江省立同德医院检验科，浙江 杭州 310012)

西罗莫司是一种具有抗真菌活性而无抗细菌活性的大环内酯类化合物[1－2]。它在临床的主要作为免疫抑制剂用于防治肾移植排斥反应[3]。由于西罗莫司对真菌极为敏感，采用药典中所推荐的多种常规微生物限度检查方法对其进行微生物限度检查存在一定困难，在5种标准验证菌株中，白色念珠菌和黑曲霉的回收率无法达到要求。笔者建立了去除西罗莫司胶囊抑制真菌作用的方法，从而为其微生物限度检查方法的建立提供了依据。

1 仪器与材料

HTY－2000B型集菌仪(杭州高得医疗器械有限公司);一次性薄膜过滤器(规格 FC502，孔径0.45 μm，材质混合纤维素，批号为201000208，杭州高得泰林医疗器械有限公司);GWP－9160型隔水式恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司);SHP－250型生化培养箱(上海精宏实验设备有限公司)。西罗莫司胶囊(某制药企业，规格1 mg)。营养琼脂培养基(批号为100406)、玫瑰红钠琼脂培养基(批号为1001122)、胆盐乳糖培养基(批号为100301)均为北京三药科技开发有限公司生产，适用性试验均符合2010年版《中国药典(二部)》规定[4]。pH为7.0的无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液(批号为091102，杭州华锦药业有限公司)。枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis[CMCC(B)63501]、金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus[CMCC(B)26003]、大肠埃希菌 Escherichia coli[CMCC(F)44102]和白色念珠菌 Candida albicans[CMCC(F)98001]均由中国医学细菌保藏中心提供;黑曲霉 Aspergillus niger[CMCC(F)98003]由中国药品生物制品检定所提供。吐温－80(使用浓度为0.1%)[5]。

2 方法[4]与结果

2.1 菌液制备

接种金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、白色念珠菌和黑曲霉的新鲜培养物至对应培养基中，分别按规定时间和温度培养。把上述培养物分别用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1 mL含菌数为50～100 CFU的菌悬液或孢子悬液。

2.2 供试品溶液制备

称取样品10 g，加pH为7.0的无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100 mL，制成1∶10的供试品贮备液。再量取1∶10供试品贮备液10 mL，加pH为7.0的无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100 mL，制成1∶100的供试品溶液。

2.3 细菌计数检查验证试验

细菌计数采用常规法，取1∶10供试品溶液1 mL，加入1 mL制备好的验证菌菌液，然后每皿加入营养琼脂培养基约20 mL，摇匀，37℃培养，观察结果。由于西罗莫司不抑制细菌的生长，采用常规方法时，金黄色葡萄球菌的回收率达到103%，枯草芽孢杆菌的回收率达到97%，大肠埃希菌的回收率达到102%。控制菌检查采用常规方法，胆盐乳糖培养基用量为100 mL时，阳性试验组可检出大肠埃希菌。故细菌计数及控制菌检查均可采用常规法。

2.4 霉菌与酵母菌计数检查验证试验

霉菌和酵母菌计数采用薄膜过滤法和增溶剂法联用，取1∶100供试品溶液1 mL，加入pH为7.0的无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液(含0.1%的吐温－80，45℃)中至100 mL，混匀。采用薄膜过滤法，将上述供试品溶液全量通过薄膜后，用pH为7.0的无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液(含0.1%的吐温－80，45℃)1000 mL冲洗滤膜(约100 mL/次，冲洗10次)，滤器内剩30 mL冲洗液时，各加入1 mL制备好的验证菌菌液，滤过，取膜贴至玫瑰红钠琼脂平板，25℃培养，观察结果。

2.5 控制菌检查验证试验

取1∶10供试品贮备液10 mL，加入胆盐乳糖培养基100 mL和50～100 CFU大肠埃希菌菌液1 mL，37℃培养，观察结果。采用不同的方法对西罗莫司胶囊进行霉菌和酵母菌检查的验证试验，回收率结果见表1。

表1 4种不同方法检查白色念珠菌和黑曲霉的回收率

3 讨论

虽然西罗莫司已在临床上使用多年，但因其具有极强的抗真菌活性，作为药物质量控制标准之一的微生物限度检查方法标准一直未建立，笔者此前也未发现相关文献的研究报道。在本试验中，笔者对西罗莫司的微生物限度检查方法进行了研究。最初采用培养基稀释法(1∶5)对西罗莫司胶囊进行霉菌及酵母菌的检查验证试验，结果白色念珠菌和黑曲霉的回收率均为零。之后参照2005年版《中国药典(二部)》附录ⅪJ方法[5]，分别尝试了离心法与培养基稀释法联用(1∶5)和离心法与薄膜过滤法联用，且离心后的薄膜过滤法采用药典所规定冲洗剂的最大冲洗量1000 mL，但回收率均达不到要求。且在离心法与薄膜过滤法联用中，黑曲霉的回收率达到了92%，但白色念珠菌的回收率还是为零。由此可见，白色念珠菌对该药物极为敏感。笔者曾采取了1∶100的供试品溶液，并用pH为7.0的无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液1000 mL分次冲洗，结果白色念珠菌和黑曲霉的回收率均达不到要求。考虑到西罗莫司微溶于水，采用薄膜过滤法，仅用水溶液作为冲洗剂无法去除抗菌成分，因此笔者最后尝试薄膜过滤法和增溶剂联用的方法，选择吐温－80作为增溶剂。首先采用1∶10的供试品溶液进行薄膜过滤法，用pH为7.0的无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液(含0.1%的吐温－80，45℃)1000 mL分次冲洗滤膜，该方法中白色念珠菌的回收率仅为27%，且胶囊内容物的白色小颗粒影响白色念珠菌的计数。根据2010年版《中国药典(二部)》附录ⅩⅨP[4]方法，进行验证试验时，若因没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用而导致微生物回收的失败，应采用能使微生物生长的更高稀释级供试品溶液进行方法验证试验。故霉菌和酵母菌计数采用1∶100的供试品溶液进行试验。笔者发现，以0.1%吐温－80为增溶剂，45℃为冲洗温度，1∶100的供试品溶液稀释比例可达到较优的试验结果，白色念珠菌的回收率为103%，黑曲霉的回收率为108%，回收率达到要求。在试验过程中，冲洗温度及供试品溶液的稀释比例需要考虑。冲洗液温度过低不利于药物的溶解，过高又会影响药品中存在的活菌。而供试品溶液的总体积又决定了冲洗是否彻底。此外，吐温－80作为增溶剂，不仅适用于此前刘鹏等[6]报道的红霉素大环内酯类抗生素微生物限度检查方法中的细菌计数，也适用于西罗莫司胶囊的霉菌和酵母菌计数。

[1]Vezina C，Kudelski A，SehgalS N.A new antifungal antibiotic I.Taxonomy of the producing Streptomycete and isolation of the active principle[J].J Antibiot，1975，28(10):721.

[2]Sehgal SN，Baker H，Vezina C.A new antifungal antibiotic Ⅱ.Fermentation，isolation and characterization[J].J Antibiot，1975，28(10):727.

[3]Vignot S，Faivre S，Aguirre D，et al.mTOR－targeted therapy of cancer with rapamycin derivatives[J].Ann Oncol，2005，16(4):525－525.

[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[M].北京:中国医药科技出版社，2010:附录107，附录219.

[5]国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[M].北京:化学工业出版社，2005:附录 94.

[6]刘 鹏，戴 翚，马仕洪，等.大环内酯类抗生素口服制剂微生物限度检查方法的建立[J].中国抗生素杂志，2009，34(6):352－358.