凌育赵,刘经亮
(1.仲恺农业工程学院化学化工学院,广东 广州 510225;2.广东食品药品职业学院,广东 广州 510520)
虎舌红(Ardisiamamillata),又名红毛毡、宝鼎红、天仙红衣、毛凉伞、金丝红珠等,为紫金牛科紫金牛属[1],具有清热利湿、活血止血、去腐生肌等功效,对跌打损伤、风湿骨痛、肺痨咳嗽、疳积肝炎等均有疗效[2]。黄酮类化合物是紫金牛属植物的主要活性成分之一[3],用于防治皮肤疾病、增强免疫力和预防心血管疾病等方面[4],具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、降血脂等广泛的生物活性与功效[5]。
目前,国内对虎舌红活性成分的研究,主要集中在挥发油、生物碱及多糖类[6~8],而对虎舌红黄酮类成分的研究尚未见相关报道。作者在前期研究的基础上,采用索氏回流法及溶剂萃取法,成功地提取了虎舌红中的总黄酮,并以芦丁为标准品,应用红外光谱仪对提取物中总黄酮的含量进行了测定。
虎舌红全草由广东省农科院芳村花卉基地提供,经仲恺农业工程学院植物研究室鉴定为紫金牛科(Myrsinacese)紫金牛属(Ardisia)虎舌红。
芦丁标准品,中国药品生物制品检定所;溴化钾、盐酸、乙醇、石油醚、乙酸乙酯、镁粉等,均为分析纯。
IRPrestige21型傅立叶变换红外光谱仪,美国NICOLET公司;752C型紫外可见分光光度计,上海第三分析仪器厂;KQ3200DE型数控超声波清洗器,苏州江东精密仪器有限公司;FA-1004型电子天平,上海精密科学仪器有限公司;RE-52型旋转蒸发仪,上海亚荣公司。
1.2.1 虎舌红总黄酮的提取
称取粉碎过筛的虎舌红粉末20.0 g,置于烧瓶中,加入8 BV 75%(体积分数,下同)的乙醇,于80 ℃下索氏回流提取5次,每次2.5 h。抽滤,收集滤液,减压回收乙醇溶剂,挥干,浓缩得浸膏0.45 g。用适量热水溶解浸膏,趁热过滤除去不溶物,然后加入1/3体积的石油醚(脱脂,并除去部分色素),振荡静置分层;弃去石油醚溶解物,在萃取后的水溶液中加入1/3体积的乙酸乙酯萃取4次,收集乙酸乙酯相,旋转蒸发仪挥去溶剂得总黄酮0.38 g,收率1.90%。
1.2.2 虎舌红总黄酮的鉴定
(1)HCl-镁粉反应。取上述提取物少许,置于试管中,加75%乙醇 2 mL,在水浴中加热溶解,滴加浓盐酸2滴,再加镁粉约 0.50 g,即发生剧烈反应,生成的泡沫呈明显红色,溶液颜色逐渐由黄色变为橙红色。据此鉴定提取物为黄酮类物质。
(2)红外光谱鉴定。取烘干后的芦丁少许,加入一定量的溴化钾,制成固体压片,用傅立叶变换红外光谱仪在扫描范围 4000~400 cm-1、分辨率 4 cm-1、扫描次数为 4的条件下绘制红外光谱图;同法绘制精制虎舌红提取物的红外光谱图,对比鉴定。
A.芦丁标准品 B.虎舌红提取物
由图1可知,芦丁标准品和虎舌红提取物的红外光谱分别在3296.90~3425.78 cm-1左右均出现宽而强的吸收峰,是-OH的伸缩振动峰,表明存在酚羟基或糖上的羟基,且数目较大;在2973.34 cm-1处出现弱吸收峰,是碳氢键的伸缩振动峰,说明饱和碳上的氢较少;在1655.80 cm-1、1662.15 cm-1处出现 C=O的伸缩振动中强峰,两者位置和峰型一样,说明提取物是黄酮类物质;在1614.50 cm-1、1505.81 cm-1处出现强吸收峰,是芳环中C=C的伸缩振动吸收峰,也是黄酮的特征吸收峰;在 1093.21 cm-1左右出现较强吸收峰,是C-O的伸缩振动峰;在1355.60 cm-1、1143.25 cm-1处出现羟基的弯曲振动峰;在 807.28 cm-1处出现苯环邻位氢引起的吸收峰;在 1000~600 cm-1处出现苯环上取代基位置引起的吸收峰,但峰位置不同,说明提取物与芦丁的羟基取代位置不同;其它位置的吸收峰基本一致。这些表明,提取物中含有羟基、羰基、碳氧单键以及不同位置取代的苯环等官能团,特征吸收峰一致。因此可确定提取物是黄酮类化合物。
以芦丁为对照品,采用NaNO2-AlCl3比色法测定总黄酮含量[6]。
2.2.1 标准曲线的绘制
准确移取40 μg·mL-1芦丁标准溶液0.00 mL、2.00 mL、4.00 mL、6.00 mL、8.00 mL、10.00 mL于50 mL容量瓶中,加入0.50 mol·L-1NaNO2溶液1.00 mL,摇匀,静置5 min;加入0.30 mol·L-1AlCl3溶液1.00 mL,摇匀;加入1.00 mol·L-1NaOH溶液5.00 mL、50%乙醇定容至刻度,放置15 min,于410 nm处测定吸光度。以吸光度(A)对浓度(c)进行线性回归,得回归方程为A=0.4275c+0.0003,R=0.9987,芦丁在0.080~0.400 mg·mL-1范围内呈良好线性关系。
2.2.2 含量测定
取适量样品溶液,按2.2.1方法测定吸光度,据回归方程计算得总黄酮含量为19.54 mg·g-1。
2.3.1 标准曲线与检出限
黄酮类化合物4-位大多数有羰基,这是黄酮类化合物分子结构特征。红外光谱图中,在 1662.15~1505.81 cm-1范围内羰基有较强的吸收,其吸收强度与含量有关,且不易受其它峰的影响,因此选择羰基峰为定量峰,红外定量峰面积由两侧的峰谷确定。
在定量程序中建立标准品的红外光谱图,以1662.15~1505.81 cm-1范围内吸光度(A)的面积值作为定量值,用傅立叶变换红外光谱仪的朗伯-比耳定量程序建立标准曲线。以芦丁质量(M,mg)对峰面积(S)进行线性回归,得到:M=0.0359S-0.3547,相关系数为0.9803。本方法的检出限为0.04 mg。
2.3.2 含量测定
准确称取样品溶液6份,称取相应的溴化钾使质量总和在0.0850~0.0860 g之间。按2.3.1方法绘制红外光谱图,应用朗伯-比耳定量程序计算,结果见表1。
表1 红外光谱测定提取物中总黄酮含量
由表1可知,提取物中总黄酮的平均含量为19.47 mg·g-1。与紫外可见分光光度法测定结果基本一致。
2.3.3 吸光系数K
从红外光谱图上得到样品的吸光度,再根据固体压片的厚度计算吸光系数K为2.379×103g·cm-1。
采用测定标准品(芦丁)和试样加标回收实验方法,进行加标回收率实验,结果见表2。
表2 加标回收率实验结果
由表2可知,回收率在93.54%~104.35%之间,平均回收率为98.72%;其相对标准偏差(RSD)为 2.09%(n=6),说明方法精密度高。
应用红外光谱法测得虎舌红中的总黄酮含量为19.47 mg·g-1,与紫外可见分光光度法测定结果(19.54 mg·g-1)基本一致。红外光谱法测定虎舌红中总黄酮含量时吸光系数达到 2.379×103g·cm-1,吸光系数K较小,适合于常量分析,相对标准偏差(RSD)为2.09%(n=6),加标回收率为93.54%~104.35%,平均回收率为98.72%。该法操作简便、结果可靠,可用于黄酮类有效成分的质量监控。
[1] 卢其能.虎舌红的生物学特性与组织培养研究[J].江西林业科技,2002,(1):5-6.
[2] 赵亚,刘合刚.紫金牛属植物研究近况[J].中草药,1999,30(3):228-231.
[3] 姚新生.天然药物化学(第二版)[M].北京:人民卫生出版社,1996:194.
[4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典一部[M].北京:化学工业出版社,2000:629.
[5] 黄河胜,马传庚,陈志武.黄酮类化合物药理作用研究进展[J].中国中药杂志,2000,25(10):589-592.
[6] 凌育赵,曾满枝,严志云.超临界萃取气-质联用分析虎舌红挥发油化学成分[J].精细化工,2005,22(10):766-769.
[7] 凌育赵,曾满枝.虎舌红生物碱类成分的提取分离与结构鉴定[J].精细化工,2007,24(7):667-670.
[8] 凌育赵,曾满枝.虎舌红多糖的分离纯化与性质研究[J].分析试验室,2007,26(4):93-96.