灯盏花石油醚部分化学成分的HPLC-ESI-MS/MS分析

高 婷，胡 倩，潘志权

(武汉工程大学化工与制药学院 绿色化工过程省部共建教育部重点实验室，湖北 武汉 430073)

灯盏花，又名灯盏细辛，为菊科飞蓬属短葶飞蓬(Erigeronbreviscapus(vant.) Hand.-mass)的干燥全草。主要分布于我国的西南地区，其性寒，味微苦，甘温辛，具有散热解表、活血化瘀、通经活络、舒经治瘫、祛风除湿和消炎止痛等功效[1]。自1979年以来，灯盏花已被制成针剂和片剂应用于临床，主要用于治疗缺血性心脑血管疾病[2]。

近年来，国内外学者对灯盏花进行了化学成分的研究，从中分离鉴定得到60多种成分[3～5]，主要成分为黄酮及黄酮苷类、芳香酸类、萜类、糖苷(主要是灯盏花苷)类。其中灯盏花素(含灯盏甲素和灯盏乙素)被认为是灯盏花中的主要活性成分。

HPLC-ESI-MS/MS技术具有分析速度快、分辨率高、灵敏度高的特点，能在线提供每个谱峰的分子量和结构信息，可以快速鉴定出分析样品的成分。作者在此采用HPLC-ESI-MS/MS方法对灯盏花的石油醚部分进行成分分析，为灯盏花的研究开发及其质量标准的建立提供了基础数据。

1 实验

1.1 材料、试剂和仪器

灯盏花全草由云南省红河千山生物工程有限公司提供。

乙醇、石油醚(60～90℃)、甲酸、乙酸、乙酸铵，分析纯；甲醇、乙腈，色谱纯；MilliQ水。

高效液相色谱泵(DIONEX公司)，DIONEX C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，离子阱质谱，电喷雾接口，工作站及数据处理系统(美国，Finnigan公司)。

1.2 样品制备

称取5.0 g灯盏花全草粉末置具塞烧瓶中，加入150 mL 70%乙醇，超声萃取1 h；低温减压回收溶剂，得粗浸膏1.5 g；将粗浸膏混悬于10 mL水中，用石油醚 (3×10 mL) 萃取，低温减压回收溶剂，得石油醚浸膏0.32 g；用甲醇将石油醚浸膏配成浓度为1.0 mg·mL-1的溶液，取适量离心5 min(1200 r·min-1)，吸取上清液10 mL，过0.45 μm滤膜后待用。

1.3 测试条件

色谱条件：流动相A为水(含0.1%甲酸)、B为乙腈；柱温20℃；检测波长321 nm；流速0.8 mL·min-1；进样量20 μL。梯度洗脱：0～5 min，A相77%，B相23%；5～10 min，B相从23%升至30%，A相相应降至70%；10～12 min，B相从30%逐渐升至45%，A相相应降至55%；12～15 min，B相从45%升至50%，A相相应降至50%；15～20 min，B相从50%逐渐升至55%，A相相应降至45%；20～40 min，A相为45%，B相为55%。

质谱条件：鞘气为45 unit·min-1；喷雾电压为4.5 kV；加热毛细管温度为300℃。正负离子模式检测，扫描范围m/z为150～1000，二级质谱打碎能量范围为25%～30%。

2 结果与讨论

2.1 提取液中主要成分分离

流动相条件经优化选择，确定乙腈-0.1%甲酸为流动相进行梯度洗脱，33 min内可将各组分较好地分离。灯盏花石油醚部分样品经高效液相色谱分离后得到20个色谱峰，其中5个峰由于离子化不好，基线干扰较大，未取得质谱数据。灯盏花石油醚提取物在相应的总离子流图(图1)中分别编号为峰1～5。

图1 灯盏花石油醚浸提物在正模式(a)和负模式(b)的总离子流图

2.2 化合物的鉴定

根据样品的来源，已知样品中可能含有灯盏乙素、灯盏甲素、芹菜素等，通过分析MS/MS信息，并与已报道的文献资料相对照，鉴定出其中两种黄酮为灯盏甲素和芹菜素，此外推测出其中含有黄芩苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、山矾碱或阿西米罗宾。

峰1～5的质谱图见图2～6。

图2 峰1的MS和MS2谱图

化合物1(tR=6.18 min)，紫外光谱在280 nm 和355 nm处有最大吸收，显示黄酮类化合物的特征吸收峰。由图2可知，化合物1一级质谱的分子离子峰为m/z463 [M+H]+，推测分子质量M=462，其二级质谱图出现碎片离子峰m/z287 [M+1-176]+，即为失去葡萄糖醛酸后的苷元碎片离子峰。根据样品来源及与文献对比[6]，判断化合物1为灯盏乙素。

图3 峰2的MS和MS2谱图

化合物2(tR=8.95 min)，紫外光谱在270 nm、330 nm处有吸收峰，为典型的黄酮类化合物紫外的带Ⅰ和带Ⅱ特征峰。由图3可知，化合物2一级质谱的分子离子峰为m/z447 [M+H]+，推测分子质量M=446，其二级质谱图出现碎片离子峰m/z271 [M+1-176]+，即为失去葡萄糖醛酸后的苷元碎片离子峰。化合物2与灯盏乙素分子量相差16，主要的二级碎片也相差16，推测该化合物比灯盏乙素少了一个羟基，结合文献报道[6]，判断化合物2为黄芩苷。

图4 峰3的MS和MS2谱图

化合物3(tR=15.55 min)，紫外光谱在290 nm处有一个吸收峰。由图4可知，化合物3一级质谱的分子离子峰为m/z268 [M+H]+，推测分子质量M=267，说明分子中含有奇数个N，化合物二级和三级质谱的主要碎片峰为m/z251和222，根据文献[7]，符合该分子量和电喷雾规律的化合物有两个同分异构体，分别为山矾碱和阿西米罗宾。由于缺乏其它信息，无法确认属于哪一种化合物。

图5 峰4的MS和MS2谱图

化合物4(tR=16.04 min)，紫外光谱在295 nm处有最大吸收。由图5可知，化合物4一级质谱的分子离子峰为m/z433 [M+H]+，推测分子质量M=432，其二级质谱没有给出质谱数据。根据样品来源和文献对比[8]，判断化合物4为芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷。

图6 峰5的MS和MS2谱图

化合物5(tR=17.12 min)，紫外光谱在265 nm和335 nm处有最大吸收，显示黄酮化合物的特征吸收。

由图5可知，化合物5一级质谱的分子离子峰为m/z269 [M-H]-，推测分子质量M=270，其二级质谱的主要碎片峰为m/z225，根据样品来源及文献对比，与标准品芹菜素对照且紫外吸收也一致，故判断化合物5为芹菜素。

3 结论

运用HPLC-ESI-MS/MS技术对灯盏花石油醚提取物复杂成分进行了快速的分离和表征。根据质谱和串联质谱，并结合UV谱图及文献报道对灯盏花HPLC分离出的20个主要峰进行分析，确定了5个主要成分的可能结构，分别为灯盏乙素、黄芩苷、芹菜素、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、山矾碱或阿西米罗宾。这些成分在灯盏花化学成分分析中曾有报道。从总离子流色谱图可以看出，灯盏花石油醚部位所含的成分十分复杂，一些量大的化合物还未能鉴定，有待进一步的研究。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京：化学工业出版社，2005：100.

[2] 刘长庚，黄生高，范国才.灯盏花的研究进展[J].中华医学写作杂志，2005，12(14)：1239-1243.

[3] 张卫东，陈万生，王永红.灯盏花黄酮苷化学成分的研究[J].中草药，2000，31(8)：565-566.

[4] 黄洪波，包文芳，杨芳芳，等.灯盏花的化学成分研究[J].沈阳药科大学学报，2001，18(4)：266-267，293.

[5] 王玲，肖艳华，胡倩，等.灯盏花素研究进展[J].化学与生物工程，2007，24(9)：9-12.

[6] 梁振，段继诚，张维冰，等.HPLC-ESI-MS/MS对灯盏花提取液中主要成分的分离定性[J].分析科学学报，2004，20(2)：129-132.

[7] 丛浦珠，李笋玉.天然有机质谱学[M].北京：中国医药科技出版社，2003：274.

[8] 张卫东，陈万生，王永红，等.灯盏花中两个新苷类化合物的结构鉴定[J].中国中药杂志，2001，26(10)：689-690.