海产养殖饵料四爿藻的生长评价

李红丽，胡鸿钧，李夜光，欧阳叶新

(1.中南民族大学工商学院，湖北 武汉 430065；2.中国科学院武汉植物研究所，湖北 武汉 430074)

四爿藻(Tetraselmis)是一类单细胞绿藻[1]，因其特殊的系统位置和化学组成，近来受到国际学者的普遍关注[2]。四爿藻含叶绿素a、叶绿素b及丰富的营养物质，作为饵料广泛用于水产养殖[3～5]。四爿藻生活史包括运动的四鞭毛期(生物量累积时期)和不运动的营养细胞期(静止相)，饵料生产要求收获运动的四鞭毛期细胞。在人工大规模培养四爿藻饵料过程中，需要及时检测四爿藻的生长情况。目前，评价绿藻生长状况的方法主要有细胞计数法、活体细胞荧光法和叶绿素含量分光光度计检测法[6]。其中活体细胞荧光法需要昂贵的仪器设备，理论复杂，人为误差较大，实际运用较少。细胞计数法较为可靠，但需要显微镜和专业人员进行测定，而且运用比较麻烦，不适合普通人员进行大规模培养时采用。藻类细胞含有进行光合作用的捕光色素分子和代谢衍生物，利用其特征光密度吸收值表示细胞密度已有大量报道[7]。作者在此对普遍采用的四爿藻生物量累积时期生长状况的评价方法进行比较，旨在寻找适合于评价四爿藻生活史运动时期细胞生长状况的准确、简便、快捷的方法。

1 实验

1.1 材料

实验所用藻种为3个不同种的海洋四爿藻：朱氏四爿藻(TetraselmischuiWH01)、心形四爿藻 (T.cordiformisWH02)，采自山东省青岛市沿海地区；大四爿藻(T.helgolandicaWH03)，采自浙江省象山县。藻种由中科院武汉植物研究所藻种库提供。

1.2 四爿藻的培养

将3种四爿藻藻种接种于改良的适合于水产养殖的四爿藻培养基[8]中，置于RH-150-G型恒温光照培养箱中(20±2)℃下持续光照培养，光强2000～ 4000 lx，摇床转速120 r·min-1。

1.3 四爿藻的生长评价

1.3.1 细胞计数

分别取待测的四爿藻培养物(培养前6 d)，用Lugol氏固定液固定，血球计数法计数。每样品重复4次，求平均值，绘制生长曲线。

1.3.2 叶绿素含量测定

采用快速微量提取法进行[6]，略作改动。离心收获不同生长期的四爿藻培养物，加入 95%乙醇研磨(补足体积)后室温下抽提4～6 h，离心取上清，乙醇重提，直至抽提充分(共抽提3次)。合并上清，用722型分光光度计检测OD649和OD665值。根据下面公式计算叶绿素a(Chl a)、叶绿素b (Chl b)的含量(μg·mL-1)，每样品重复4次，求平均值，绘制生长曲线并与细胞计数法绘制的生长曲线进行比较 。

Chl a 含量 = 13.7×OD665-5.76×OD649

Chl b含量 = 25.8×OD649-7.6×OD665

1.3.3 特定光密度值测定

采用722型分光光度计直接测定四爿藻培养物在不同波长(560 nm、625 nm、750 nm) 下的光密度值，绘制生长曲线，并与细胞计数法绘制的生长曲线进行比较。

1.3.4 数据处理及分析

采用Origin v6.0 作图，分析生长曲线的差异，并对3种四爿藻据叶绿素a的平均含量绘制的生长曲线进行回归，并与细胞计数法得到的生长曲线回归结果进行比较。

2 结果与讨论

2.1 特定光密度值的测定结果与细胞计数法结果的比较(图1)

图1 朱氏四爿藻(A)、心形四爿藻(B)、大四爿藻(C)的生长曲线(根据几组特定光密度值绘制)

从图1可看出，朱氏四爿藻的OD560、OD625、OD750变化，在前3 d与细胞数目的变化趋势一致，均能反映生长变化规律；第4～5 d也与细胞数目的变化趋势基本一致，但稍微偏低；第5～6 d，细胞数目开始减少，但OD560、OD625、OD750仍在增加，表现出与前者相反的变化趋势。另外，OD560、OD625、OD750的变化趋势差异不大。由此看来在第6 d朱氏四爿藻的OD560、OD625、OD750结果与细胞计数法结果有较大的出入，不能代表细胞计数法的结果。

心形四爿藻和大四爿藻的OD560、OD625、OD750变化与细胞计数法的结果比较，表现出与朱氏四爿藻类似的变化规律。这说明OD560、OD625、OD750变化与四爿藻藻种的差异性关系不明显(P=0.005)。

2.2 叶绿素a 和叶绿素b的测定结果与细胞计数法结果的比较(图2)

图2 朱氏四爿藻(A)、心形四爿藻(B)、大四爿藻(C)的生长曲线(根据叶绿素a、b含量绘制)

从图2可看出，朱氏四爿藻前6 d的叶绿素a含量变化与细胞数目变化基本一致，而叶绿素b含量变化则或多或少呈现出一定的波动性，重复实验结果也是如此。因此，叶绿素b含量变化不如叶绿素a含量变化规则，这说明叶绿素a含量变化与细胞数目变化较为吻合。心形四爿藻和大四爿藻也得到了类似的结论。这说明叶绿素a、b含量变化与四爿藻藻种的差异性变化关系不显著(P=0.005)。

2.3 叶绿素a含量变化的回归曲线分析

鉴于叶绿素a含量变化与四爿藻藻种差异性不显著，将3种四爿藻的叶绿素a平均含量求对数值，再进行线性回归分析(图3A)，发现回归曲线与数据吻合很好，其回归方程为：Y=0.2808eX/1.90124。

将细胞计数法结果作同样处理后，进行线性回归(图3B)，也呈现类似的直线，仅相关系数和截距有些许差异，其回归方程为：Y=-38299.5+38321.9eX/3666.2。

图3 3种四爿藻叶绿素a平均含量和细胞数目变化曲线的回归分析

由图3可以看出，叶绿素a含量变化和细胞数目变化均呈规则的指数生长曲线，这表明在大规模培养四爿藻时用叶绿素a含量变化间接反映细胞数目变化具备可行性。因为海产饵料生产中并不需要准确测定细胞数目，只需确定其最佳收获四爿藻的时间而获得最大收获效率即可。因此，叶绿素a含量测定可以满足这一需要。即用叶绿素a这一指标来评价四爿藻的四鞭毛运动期(生物量累积时期)的生长状况较为科学、可靠。

3 结论

通过测定3种四爿藻的细胞数目、叶绿素a和叶绿素b的含量变化及几种波长下的特征光密度吸收值，分别绘制生长曲线。结果表明，叶绿素b含量变化和OD560、OD625、OD750变化与生长趋势不太吻合，而叶绿素a含量变化和细胞数目变化较为一致，呈现较为规则的指数生长曲线。表明了利用叶绿素a含量变化可评价四爿藻生长状况。此外，叶绿素a含量测定方法较为直接，只需取少量细胞(1 mL 即可) 经过乙醇简单抽提，再测定光密度值，方法简便、快捷，较适合大规模海产养殖的需求。

[1]Fabregas J，Dominguez A，Regueiro M，et al.Optimization of culture medium for the continuous cultivation of the microalgaHaematococcusplucialis[J].Appl Microbiol Biotechnol，2000，53(5)：530-535.

[2]罗立明，欧阳叶新，胡鸿钧.海洋单细胞四爿藻基因组DNA的微量提取[J].武汉植物学研究，2003，21(4)：295-300.

[3]山东海洋学院.海水养殖手册[M].上海：上海科技出版社，1985:582-623.

[4]陈明耀.生物饵料培养[M].北京：中国农业出版社，1995：27-28.

[5]张成武，胡鸿钧.朱氏扁藻作为中国对虾幼体饵料的效果试验[J].海洋科学，1993，(5)：38-41.

[6]Lobban C S，Chapman D J，Kremer B P.Experimental Phycology.A Laboratory Manual[M].New York：Cambridge University Press,1988：16-93.

[7]沈萍萍，王朝晖，齐雨藻，等.光密度法测定微藻生物量[J].暨南大学学报(自然科学与医学版)，2001，22(3)：115-119.

[8]欧阳叶新，罗立明，胡鸿钧，等.我国沿海四爿藻的室内培养[J].应用生态学报，2003，14(10)：1701-1704.